小鼠b7dc胞外段原核表达载体的构建及表达

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1、小鼠B7DC胞外段原核表达载体的构建及表达：樊燕,江文正,张亚丽,闻洁君,郝文丽,钱旻【摘要】　　目的:构建小鼠B7DC胞外段基因的原核表达载体,并在E.coliBL21中诱导表达。方法:从小鼠骨髓的未成熟树突状细胞（DC）中提取总RNA,经RTPCR扩增B7DC胞外段,并将其克隆至原核表达载体pET32a(+)中,构建重组表达质粒pET32a(+)B7DCECD。重组质粒经双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coliBL21,经IPTG诱导表达目的蛋白,并用SDSPAGE和r约为41000的B7DC胞外段蛋白。结论:

2、成功地构建了小鼠B7DC胞外段基因原核表达载体,并在E.coliBL21中进行表达,为进一步研究B7DC的功能奠定实验基础。【关键词】B7DC基因克隆原核表达　　[Abstract]AIM:ToconstructaprokaryoticexpressionvectorfortheextracellulardomainofmurineB7DC(B7DCECD)gene,andtoexpressthegeneinE.coliBL21.METHODS:ThetotalRNAmurineimmaturebonemarroentof

3、B7DCcDNAplifiedbyRTPCR.TherebinantplasmidpET32a(+)B7DCECDentofB7DCcDNAintotheprokaryoticexpressionvectorpET32a(+).AftertherebinantplasmidedintoE.coliBL21throughIPTGinductiontoexpressthetargetprotein,andtheproteinentB7DCcDNAedrightbyDNAsequencing.SDSPAGEandCSF购

4、自吉泰生物科技有限公司。IPTG、细胞总RNA提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒均购自北京鼎国生物技术公司。DNALadder、AntiHisAntibody、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG和增强型HRPDAB底物显色试剂盒均购自北京TIANGEN公司。大肠杆菌DH5α、BL21、质粒载体pET32a(+)均由本实验室保存。　　1.2方法　　1.2.1小鼠DC的培养及细胞总RNA的提取小鼠骨髓的DC的制备按常规方法进行[4]。当骨髓细胞用rmIL4和rmGMCSF诱导分化成未成熟DC时,离心收集细胞,按RNA抽提

5、试剂盒介绍的方法抽提细胞总RNA,紫外分光光度法测定其浓度和纯度后置-70℃保存。　　1.2.2B7DC胞外段基因的克隆以抽提的细胞总RNA为模板,以oligodT(20)为引物进行反转录,反应条件为42℃20min,99℃5min,4℃10min。取逆转录产物直接用于下一步常规PCR扩增,反应条件为95℃2min,94℃30s,55℃30s,72℃1min,循环30次后,72℃延伸10min。根据GenBank公布的小鼠B7DC基因序列设计PCR引物（由上海生工公司合成）,用于扩增B7DC胞外段(76～657bp)编码基因

6、。上游引物序列为5′GGAATTCCCTAAAGAAGTGTACACCG3′（划线部分为EcoRⅠ酶切位点）,下游引物序列为5′CCGCTCGAGTTAGACTTTGGGTT3′（划线部分为XhoⅠ酶切位点）。　　1.2.3原核表达载体pET32a(+)B7DCECD的构建用EcoRⅠ和XhoⅠ分别酶切PCR产物与pET32a(+)质粒,经琼脂糖凝胶回收,将载体和目的片段用T4DNA连接酶16℃过夜连接。转化和重组质粒的酶切鉴定按常规方法进行。将经双酶切初步鉴定正确的重组质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司测序,阳性

7、质粒命名为pET32a(+)B7DCECD(胞外段)。　　1.2.4小鼠B7DC蛋白的诱导表达和SDSPAGE分析将重组质粒pET32a(+)B7DCECD转化大肠杆菌BL21,挑取单菌落到含有100mg/L氨苄的3mLLB培养基中,37℃培养过夜。次日按1∶100转接后,37℃培养至A600达0.6～0.8。吸取部分样品作为对照,然后加入终浓度为1mmol/L的IPTG,37℃诱导培养5h。取少量细菌离心收集菌体,加入适量SDSPAGE上样缓冲液,煮沸10min,离心取上清进行120g/LSDSPAGE,分析B7

8、DC表达水平,同时以未诱导的重组菌作为对照。　　1.2.5B7DC蛋白的Westernblot检测SDSPAGE分离蛋白后,将蛋白电转移至硝酸纤维素膜上,丽春红染液预染。硝酸纤维素膜经封闭后依次与AntiHisAntibody（1∶2000