小鼠b7dc胞外段原核表达载体的构建及表达

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1、小鼠B7DC胞外段原核表达载体的构建及表达作者：樊燕,江文正,张亚丽,闻洁君,郝文丽,钱旻【摘要】　　目的:构建小鼠B7DC胞外段基因的原核表达载体,并在E.coliBL21中诱导表达。方法:从小鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞（DC）中提取总RNA,经RTPCR扩增B7DC胞外段,并将其克隆至原核表达载体pET32a(+)中,构建重组表达质粒pET32a(+)B7DCECD。重组质粒经双酶切鉴定及序列测定后,转化E.coliBL21,经IPTG诱导表达目的蛋白,并用SDSPAGE和Westernblot进行检测。结果:获得全长为582bp的小鼠B7DC胞外段基因

2、,经测序证实其序列正确。SDSPAGE和Westernblot分析证实重组质粒可表达出Mr约为41000的B7DC胞外段蛋白。结论:成功地构建了小鼠B7DC胞外段基因原核表达载体,并在E.coliBL21中进行表达,为进一步研究B7DC的功能奠定实验基础。【关键词】B7DC基因克隆原核表达　　[Abstract]AIM:ToconstructaprokaryoticexpressionvectorfortheextracellulardomainofmurineB7DC(B7DCECD)gene,andtoexpressthegeneinE.coliBL21.ME

3、THODS:ThetotalRNAwasextractedfrommurineimmaturebonemarrowderived11dendriticcellsandtheextracellularfragmentofB7DCcDNAwasamplifiedbyRTPCR.TherecombinantplasmidpET32a(+)B7DCECDwasconstructedbycloningtheextracellularfragmentofB7DCcDNAintotheprokaryoticexpressionvectorpET32a(+).Afterthere

4、combinantplasmidwasidentifiedbyrestrictionendonucleasedigestionanalysisandDNAsequencing,pET32a(+)B7DCECDwastransformedintoE.coliBL21throughIPTGinductiontoexpressthetargetprotein,andtheproteinwasanalyzedbySDSPAGEandWesternblot.RESULTS:A582bpofextracellularfragmentB7DCcDNAwasobtainedandth

5、esequencewasconfirmedrightbyDNAsequencing.SDSPAGEandWesternblotanalysisshowedthataproteinwithmolecularweightof41000wasexpressedinE.coliBL21.CONCLUSION:TheextracellularfragmentofB7DCissuccessfullyclonedintopET32a(+)andexpressedinE.coliBL21,whichlaysafoundationforthefurtherfunctionalresearc

6、hofB7DC.　　[Keywords]B7DC;genecloning;prokaryoticexpression　　T细胞的活化需要双信号系统:一是TCR与抗原肽MHC复合物的相互作用;二是共刺激分子所提供的协同刺激信号。B7家族作为惟一能从抗原提呈细胞单向传送信号至T细胞的共刺激分子[1],11已逐渐成为当今免疫学研究的一个重点领域。B7DC（PDL2）作为B7家族的第5个成员,是Tseng等[2]在2001年研究树突状细胞（DC）和活化的巨噬细胞基因差异表达中被发现的。鼠类的B7DC基因位于第9号染色体上,其cDNA全长约为1700bp,相对分子质量（Mr

7、）约25000,可编码247个氨基酸。B7DC选择性表达于DC上,骨髓和脾来源的成熟或未成熟的DC均可表达B7DC。B7DC与PD1以配体受体的形式结合,不仅在T细胞活化的过程中提供负调节信号,而且在自身免疫性疾病的发生、维持机体的外周耐受和肿瘤免疫方面发挥重要的作用[2,3]。为此,我们构建鼠B7DC胞外段原核表达载体,并在E.coliBL21中表达,为今后研究B7DC的功能奠定基础。　　1材料和方法　　1.1材料BALB/c小鼠（6～8周龄）购自中科院上海实验动物中心。EcoRⅠ、Xho