小鼠light胞外段基因原核表达载体构建和其多克隆抗体制备

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1、小鼠LIGHT胞外段基因原核表达载体构建和其多克隆抗体制备【摘要】目的:PCR扩增小鼠LIGHT胞外段基因(LIGHTECD),构建含LIGHTECD的原核表达载体，诱导表达重组蛋白，并免疫新西兰兔，制备多克隆抗体。方法：提取小鼠骨髓来源的未成熟树突状细胞中的总mRNA,RT-PCR技术扩增LIGHTECD,克隆至原核表达质粒pGEX-6P-2中，构建重组表达载体pGEX-6P-2-LIGHTECDo重组质粒进行PCR和基因测序鉴定后，转化大肠杆菌XL-1Blue,IPTG诱导表达。融合蛋白纯化后纯化后免疫新西兰兔，ELISA及Western-blot分析

2、兔血清中抗LIGHTECD抗体的效价和特异性。结果:RT-PCR扩增得到525bpLIGHTECD目的片段；经PCR和测序鉴定，证明构建的重组质粒中插入的片段为LIGHTECD基因,测序结果经BLAST分析，与Genbank上登录序列完全一致；经IPTG诱导，重组质粒表达一相对分子量(Mr)约为45kD的目的蛋白条带。ELISA检测免疫兔血清效价为1：20000o结论：成功地克隆了小鼠LIGHT胞外段基因，并表达了相应可溶性蛋白，准备了高效价的兔抗LIGHTECD多克隆抗体，为进一步研究其功能奠定了基础。【关键词】LIGHT；原核表达；免疫原性；多克隆抗体

3、LIGHT(lymphotoxin-likeinducibleproteinthatcompeteswithglycoproteinDforherpesvirusentryonTcells)最早是Mauri等［1］在对单纯疱疹病毒入侵活化T细胞的研究中发现的，是肿瘤坏死因子超家族的第14个成员，又名HVEMHL(Herpesvirusentrymdeiator-Ligand)或TNFSF14,是一种非CD28依赖的协同刺激分子。LIGHT是一种II型跨膜糖蛋白，多以三聚体形式表达于活化的T细胞、未成熟DC、单核细胞、脾细胞及粒细胞膜上，也可以分泌型形式存在

4、［2］。目前已经证实TNFSF14可以与3种膜结合型的TNF受体家族成员结合，即TNFRSF14、LTBR(lymphotoxin3receptor)和DcR3,启动不同的生物学效应。现有研究已发现，TNFSF14信号通路通过刺激T细胞增殖、分化和诱导靶细胞凋亡，在抗肿瘤免疫、诱导自身免疫病和移植排斥反应、调节神经触突的发育和脂代谢及抗感染免疫中发挥重要功能［3-9］oLIGHT作为一个多功能多效应分子，具有共刺激和细胞毒等活性，克隆LIGHT基因并获得其重组蛋白对研究该蛋白的生物学功能具有重要作用。而LIGHT胞外段基因(LIGHTECD)是其与相应受体

5、结合，从而发挥作用的关键部位，因此本实验拟克隆LIGHTECD,构建原核表达载体，表达可溶性蛋白，并制备多克隆抗体，为进一步研究其功能奠定基础。1材料与方法1.1实验动物、质粒及主要试剂4〜6w雄性C57BL/6小鼠，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。E.coliXL-1Blue及原核表达质粒pGEX-6p-2均由本研究所保存。rmIL-4(cat#404-ML)、rmGM-CSF(cat#415-ML)购自R&D公司。DNA胶回收纯化试剂盒、小量质粒提取试剂盒、限制性内切酶(BamHI,NotI)均购自TaKaRa公司。细胞总mRNA提取试剂盒、RT-

6、PCR试剂盒购自Invitrogen公司1.2树突状细胞总mRNA的提取及cDNA的合成收集小鼠骨髓来源的树突状细胞，体外用rmIL-4和rmGM-CSF刺激，诱导分化为未成熟树突状细胞。离心收集细胞，用细胞总mRNA提取试剂盒按说明书操作提取细胞总mRNA,紫外分光光度法测定其浓度和纯度后保存。按RT-PCR试剂盒介绍的方法反转录成cDNAo1.3小鼠LIGHT胞外段基因的扩增根据Pubmed数据库小鼠LIGHT基因序列，对照pGEX-6p-2载体上的多克隆酶切位点，设计LIGHTECD的特异性扩增引物。上游引物为：5’-CGG❷GATCCATAGTAG

7、CTCATCTGCCAGA-3’，下划线序列为BamHI酶切位点，下游引物为：5’-ATAAGAATGC❷GGCCGCTCAGACCATGAAAGCTCCG-3',下划线序列为NotI酶切位点。以cDNA为模板，PCR扩增LIGHTECDo扩增条件为：预变性94°C3miri后，进入变性94°C30s，退火58°C30s,延伸72°C45s的循环，共计35次，末次循环后补延72°ClOmin,终止反应。经电泳鉴定后，用DNA胶回收纯化试剂盒纯化PCR产物。1.4小鼠LIGHT胞外段基因的克隆及鉴定纯化的LIGHTECDPCR扩增产物和pGEX-6p-2空质

8、粒经BamHI和NotI双酶切后，用T4DNALigase连接，转