人sumo2基因原核表达、 纯化及多克隆抗体制备

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1、人SUMO2基因原核表达、纯化及多克隆抗体制备【摘要】目的:构建人SUMO2基因的原核表达载体,纯化融合蛋白GSTSUMO2SUMO2并以其为抗原免疫家兔,制备人SUMO2多克隆抗体。方法:用PCR的方法得到人SUMO2基因并克隆至pET41a(+)原核表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS诱导融合蛋白GSTSUMO2SUMO2表达;所获得的可溶性蛋白经亲和层析纯化、SDSPAGE电泳鉴定后,免疫家兔制备抗血清,分别采用ELISA、O2SUMO2构建成功;SDSPAGE结果证实获得Mr为52000的GSTSUMO2SUMO2

2、融合蛋白且为可溶性蛋白;经过GST亲和层析有效纯化;以该融合蛋白免疫家兔制备得到的抗血清经O2蛋白及特异性多克隆抗体,对进一步研究人SUMO2及SUMO第二类家族的功能提供了有用工具。【关键词】人SUMO2原核表达蛋白纯化抗血清　　随着2004年诺贝尔化学奖授予给发现了泛素调节的蛋白质降解的以色列科学家阿龙·切哈诺沃、阿夫拉姆·赫什科和美国科学家欧文·罗斯,近年来,对依赖于泛素及类泛素蛋白的翻译后修饰的研究成为了新的热点。其中,小泛素相关修饰物（smallubiquitinrelatedmodifier,SUMO)与蛋白的共价连接是一种新的广泛存在的翻译后

3、修饰形式,并且在真核细胞的蛋白质修饰中具有重要意义。哺乳动物中发现4种SUMO分子:按发现顺序称为SUMO1、SUMO2、SUMO3和SUMO4。与泛素类似,SUMO也是通过与靶蛋白的结合起作用的,但与泛素化介导的蛋白酶降解途径不同,SUMO化的结果并不是将蛋白分子降解,而是通过修饰来增强它们的稳定性或者调节其亚细胞定位,以及影响蛋白质的转录活性,从而发挥更加广泛的功能,比如核质转运、细胞周期调控以及信号转导等［1］。目前为止,我们知道的SUMO化修饰的底物还只是一小部分被明确鉴定,而且我们对已知的SUMO化修饰在改变许多蛋白的稳定性、定位、活性等的机理和

4、功能上还存在很多疑问。尤其是对SUMO2/3的具体作用及其与SUMO1在功能上的差异还知之甚少,因而我们通过构建SUMO2的原核表达载体,获得GSTSUMO2融合蛋白并进行纯化,由此得到人SUMO2的特异性多克隆抗体,为进一步研究SUMO2的功能及其与家族其他成员的差异打下了良好的基础。　　1材料和方法　　1.1材料质粒PET41a(+)、大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)plysS（本实验室保存）,pEYPFSUMO2（雷鸣教授惠赠）,新西兰大白兔（体质量2.5～3.0kg）2只。小量质粒提取试剂盒、DNA纯化回收试剂盒均为博大泰克公司产品

5、;限制性内切酶NocI及XhoI,T4连接酶、TaqDNA聚合酶、pfuDNA聚合酶、标准相对分子质量(Mr)蛋白均购自大连TaKaRa有限公司;IPTG购自北京索莱宝科技有限公司;卡那霉素购自北京鼎国生物工程公司;硝酸纤维素膜为德国_006936)中人SUMO2基因cDNA序列,克隆其ORF中活性蛋白区域即其162bp至441bp序列,设计合成两对引物,引物序列如下,第一对上游引物P1:5′CCGCCATGGGAATGTCCGAGGAGAAG3′;下游引物P2:5′TATGGATCCACCTCCCGTCTGCTG3′;其中上游引物含有NcoI限制性酶切

6、位点,下游引物含有BamHⅠ限制性酶切位点。第二对上游引物P3:5′TTCGGATCCATGTCCGAGGAGAAG3′;下游引物P4:5′TATCTCGAGTTAACCTCCCGTCTGCTG3′;其中上游引物含有BamHI限制性酶切位点,下游引物含有XhoI限制性酶切位点。另为做重组质粒检测用,又合成了PET41a(+)的通用引物S.Tagprimer#699453（记做Ps）:CGAACGCCAGCACATGGACAGCT7terminatorprimer#693373（记做Pt）:ACCGCTGAGCAATAACTAGCA引物合成由上海英俊生物

7、工程公司完成。　　1.2.2人SUMO2基因原核表达载体pET41a(+)SUMO2SUMO2的构建以pEYFPSUMO2质粒为模板,进行常规PCR扩增,扩增条件为:94℃预变性3min,94℃变性30s、55℃复性30s、72℃延伸30s、30个循环后,72℃延伸6min终止反应。取PCR产物用10g/L琼脂糖凝胶进行电泳,用凝胶成像仪检测电泳结果。　　将回收纯化的SUMO2第1对PCR产物和原核表达载体pET41a(+)分别用NcoI和BamHI酶切后,从琼脂糖凝胶回收pET41a(+)片段和PCR产物片段,T4连接酶连接(4℃,过夜)用含卡那霉素的

8、抗性培养基