重组鼠il28的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

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1、重组鼠IL28的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备：袁利学，刘洋，步雪峰，郑金旭，严玉兰【摘要】目的：获取重组鼠IL28（mIL28）纯化蛋白,制备多克隆抗体。方法：用PCR技术扩增鼠IL28成熟蛋白的编码序列，克隆入原核表达载体pET30，构建融合表达载体pET30amIL28，转化大肠埃希菌BL21（DE3），以IPTG诱导表达IL28融合蛋白，经镍柱亲和层析纯化，然后免疫6～8周龄鸡,制备多克隆抗体，采用ELISA检测抗体效价。结果：成功构建了表达载体pET30amIL28，DNA序列测定结果与预期结

2、果一致。在37℃培养条件下，IPTG诱导表达的IL28融合蛋白进行SDSPAGE电泳分析，发现其与融合蛋白的理论计算值一致，免疫鸡后收获抗血清,ELISA显示抗体效价具有高度特异性。结论：获得了重组鼠IL28纯化蛋白,制备了鼠IL28多克隆抗体，为进一步深入研究IL28的生物活性及其应用打下基础。【关键词】白细胞介素28；大肠埃希菌；蛋白质纯化；抗体制备　　［Abstract］Objective:Toobtainpurifiedrebinantinterleukin28ofmouse(mIL28)andprepa

3、reitspolyclonalantibody.Methods：ThecDNAfragmentcodingformaturemIL28proteinplifiedbyPCRandclonedintovectorpET30toconstructfusionexpressionvectorpET30amIL28.AfterpET30amIL28edintoE.coliBL21(DE3),thebacteriaIL28fusionproteinatography.Sixtoeightmunized.Thetiters

4、ofantibodieseasuredbyELISA.Results：TheDNAsequencingshoIL28IL28fusionproteininE.coliculturedat37℃appearedasinglebandonSDSPAGE．TheresultofELISAindicatedthatthepreparedpolyclonalantibodyhadhightiterandspecificity.Conclusion：Thepurifiedrebinantinterleukin28ofmouseand

5、polyclonalantibodyhavebeenacquired.　　［KeyIL28由本室构建；E．coliNovaBlue，E.coliBL21(DE3)均由本室保存；实验用6～8周龄鸡由南京农业大学提供；各种限制性内切酶购自美国NeIL28为模板，上游引物：TTGAATTCCCTGTCCCCAGGGCCACCAG，下游引物:CTCGAGTCAGACACACTGGTCTCCACTGGCCACACAC，上游引入EcoRⅠ位点，下游引入XhoⅠ位点，通过PCR扩增鼠IL28的成熟蛋白序列，PCR循环条件为：95℃热启动

6、预变性5min,95℃30s，64℃30s，72℃50s,共30循环，最后72℃延伸10min。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定,胶回收试剂盒回收。用T4DNA连接酶将上述PCR产物与PMD18TVector连接并转化至感受态大肠埃希菌DH5a。挑取阳性克隆扩增后，提取质粒，用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定后测序。将PMD18TVectormIL28鉴定正确的阳性质粒及原核表达载体pET30分别用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切处理，回收片段与载体，用T4DNA连接酶连接并转化至感受态大肠埃希菌DH5a。取阳性克隆扩增后

7、进行EcoRⅠ和XhoⅠ酶切鉴定，酶切产物用0.8%的琼脂糖凝胶电泳分析。　　1.2.2工程菌的诱导表达　　将重组阳性质粒pET30amIL28转化至大肠埃希菌感受态BL21中，挑取单菌落接种于LB液体培养基中（卡那霉素终浓度100μg/ml），于37℃活化过夜（14～16h）后，按1∶100的比例接菌，即50μl加入含5ml的LB的试管中（卡那霉素终浓度100μg/ml），37℃振荡培养约3h至D(600nm)值为0.4～0.6时，加入1mmol/LIPTG诱导表达3h。取菌体1ml,离心12000×g30s收获沉淀，用

8、100μl1%SDS重悬，混匀,煮沸10min。12％SDSPAGE电泳分析，电泳完毕后，用0.25%考马斯亮蓝染色液染色2h，脱色，观察电泳结果，蛋白质大小参照低分子质量蛋白标准。　　1.2.3重组鼠IL28成熟蛋白的纯化　　取培养过夜的工程菌1∶100稀