重组鼠il28的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

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　　重组鼠IL28的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备：袁利学，刘洋，步雪峰，郑金旭，严玉兰【摘要】目的：获取重组鼠IL28（mIL28）纯化蛋白,制备多克隆抗体。方法：用PCR技术扩增鼠IL28成熟蛋白的编码序列，克隆入原核表达载体pET30，构建融合表达载体pET30amIL28，转化大肠埃希菌BL21（DE3），以IPTG诱导表达IL28融合蛋白，经镍柱亲和层析纯化，然后免疫6～8周龄鸡,制备多克隆抗体，采用ELISA检测抗体效价。结果：成功构建了表达载体pET30amIL28，DNA序列测定结果与预期结果一致。在37℃培养条件下，IPTG诱导表达的IL28融合蛋白进行SDSPAGE电泳分析，发现其与融合蛋白的理论计算值一致，免疫鸡后收获抗血清,ELISA显示抗体效价具有高度特异性。结论：获得了重组鼠IL28纯化蛋白,制备了鼠IL28多克隆抗体，为进一步深入研究IL28的生物活性及其应用打下基础。【关键词】白细胞介素28；大肠埃希菌；蛋白质纯化；抗体制备　　［Abstract］Objective:Toobtainpurifiedrebinantinterleukin28ofmouse(mIL28)andprepareitspolyclonalantibody.Methods：ThecDNAfragmentcodingformaturemIL28proteinplifiedbyPCRandclonedintovectorpET30toconstructfusionexpressionvectorpET30amIL28.AfterpET30amIL28edintoE.coliBL21(DE3),thebacteriaIL28fusionproteinatography.Sixtoeightmunized.ThetitersofantibodieseasuredbyELISA.Results：TheDNAsequencingshoIL28IL28fusionproteininE.coliculturedat37℃appearedasinglebandonSDSPAGE．TheresultofELISAindicatedthatthepreparedpolyclonalantibodyhadhightiterandspecificity.Conclusion：Thepurifiedrebinantinterleukin28ofmouseandpolyclonalantibodyhavebeenacquired.　　［KeyIL28由本室构建；E．coliNovaBlue，E.coliBL21(DE3)均由本室保存；实验用6～8周龄鸡由南京农业大学提供；各种限制性内切酶购自美国NeIL28为模板，上游引物：TTGAATTCCCTGTCCCCAGGGCCACCAG，下游引物:CTCGAGTCAGACACACTGGTCTCCACTGGCCACACAC，上游引入EcoRⅠ位点，下游引入XhoⅠ位点，通过PCR扩增鼠IL28的成熟蛋白序列，PCR循环条件为：95℃热启动预变性5min,95℃30s，64℃30s，72℃50s,共30循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定,胶回收试剂盒回收。用T4DNA连接酶将上述PCR产物与PMD18TVector连接并转化至感受态大肠埃希菌DH5a。挑取阳性克隆扩增后，提取质粒，用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定后测序。将PMD18TVectormIL28鉴定正确的阳性质粒及原核表达载体pET30分别用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切处理，回收片段与载体，用T4DNA连接酶连接并转化至感受态大肠埃希菌DH5a。取阳性克隆扩增后进行EcoRⅠ和XhoⅠ酶切鉴定，酶切产物用0.8%的琼脂糖凝胶电泳分析。　　1.2.2工程菌的诱导表达　　将重组阳性质粒pET30amIL28转化至大肠埃希菌感受态BL21中，挑取单菌落接种于LB液体培养基中（卡那霉素终浓度100μg/ml），于37℃活化过夜（14～16h）后，按1∶100的比例接菌，即50μl加入含5ml的LB的试管中（卡那霉素终浓度100μg/ml），37℃振荡培养约3h至D(600nm)值为0.4～0.6时，加入1mmol/LIPTG诱导表达3h。取菌体1ml,离心12000×g30s收获沉淀，用100μl1%SDS重悬，混匀,煮沸10min。12％SDSPAGE电泳分析，电泳完毕后，用0.25%考马斯亮蓝染色液染色2h，脱色，观察电泳结果，蛋白质大小参照低分子质量蛋白标准。　　1.2.3重组鼠IL28成熟蛋白的纯化　　取培养过夜的工程菌1∶100稀释于LB培养基中，置37℃振荡培养大约3h至D(600nm)为0.4～0.6，加入1mmol／LIFFG30℃诱导表达3h后,取200ml细菌培养物5000r/min离心10min，沉淀重悬于8mlDenaturingBinding缓冲液，室温缓缓摇动5～10min，将其置于冰上超声30min，超声10s，暂停10s。将裂解物5000r/mim离心15min，收集上清，然后按NiNTAHisBindResin说明书操作，重复操作2次，对可溶性表达蛋白进行纯化，将上柱前裂解液、上柱后裂解液进行SDSPAGE分析。　　1.2.4重组鼠IL28成熟蛋白的透析复性　　剪取适当长度透析袋。在大体积2％（D18TVectormIL28为模板，经PCR扩增获得编码鼠IL28成熟蛋白的DNA序列，大小为520bp，将扩增的序列插入pET30载体，构建重组表达载体pET30amIL28。挑取阳性克隆，经菌落PCR、经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定和DNA序列测定，结果均与预期设想一致，表明该载体构建成功（图1）。在37℃振荡培养条件下，诱导表达的IL28可溶形式融合蛋白经NiNTA亲和层析纯化后，获得了高纯度重组IL28融合蛋白。上柱前裂解液、上柱后裂解液进行SDS PAGE后，经凝胶图像分析系统分析显示，目的蛋白(IL28)具有极高纯度(图3)。2.4ELISA方法检测多克隆抗体效价将多抗进行倍比稀释，用间接ELISA方法进行检测。多克隆抗体稀释倍数为10，100，1000，10000，100000时，其D值分别为3.5，3.32，2.27，1.78，0.94。多克隆抗体的抗体效价达1∶1×105。　　3讨论　　大肠埃希菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌,它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉,可以快速大规模地生产目的蛋白等优点［4］,而且其表达外源基因产物的水平远高于其他基因表达系统,表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的30%,因此大肠埃希菌目前在蛋白质表达中应用最广泛［5］。pET系统是在大肠埃希菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统，最初由Studier等［6］利用与启动子配套能高效转录特定基因的外源RNA聚合酶构建的T7RNA聚合酶/启动子系统［7］,可以从各种基因（包括原核、真核细胞）生产大量的目的蛋白。本研究表达的重组mIL28蛋白主要以包涵体形式存在,容易通过离心收获包涵体,有利于分离纯化；包涵体能保护蛋白免受蛋白酶水解;目的蛋白以无活性的包涵体形式表达，不会影响宿主菌生长。该包涵体经变性溶解后进行分离纯化,其变性溶解产物通过Ni柱得到了进一步亲和纯化,回收的目的产物SDSPAGE经凝胶图像分析系统分析显示，表现为27ku条带（图3），表明用Ni柱进行亲和层析具有高效、高容量、快速的特点。纯化后包涵体的复性过程主要包括肽链折叠和分子内二硫键的氧化,适当折叠的肽链常常有利于正确二硫键的形成。目前蛋白质复性通常有透析复性和稀释复性两种方法。本实验采用透析进行变性mIL28的复性。实验结果表明,整个复性过程未见明显沉淀产生,表达产物由变性失活状态转变成具有活性的复性物。利用纯化蛋白免疫实验用鸡，成功制备该蛋白的多克隆抗体，ELISA检测抗体效价达1/100000，发现该抗体具有高度特异性，本研究可制备大量纯化蛋白和多克隆抗体,为进一步探索IL28的蛋白结构、生物学效应及其生物学作用机制提供了依据。【参考文献】　［1］SheppardP,Kindsvogelurineinterferonlambdas(typeIIIinterferons)exhibitpotentantiviralactivityinvivoinapoxvirusinfectionmodel［J］.JGenVirol,2005,86(Pt6):1589-1596. 　　［4］NucP,NucK.RebinantproteinproductioninEscherichiacoli［J］.PostepyBiochem,2006;52(4):448-456.　　［5］DongX,TangB,LiJ,etal.Expressionandpurificationofintactandfunctionalsoybean(glycinemax)seedferritinplexinEscherichiacoli［J］.JMicrobiolBiotechnol,2008,18(2):299-307.　　［6］StudierFethodsEnzymol,1990,185:60-89.　　［7］KangY,SonMS,HoangTT.OnestepengineeringofT7expressionstrainsforproteinproduction:increasingthehostrangeoftheT7expressionsystem［J］.ProteinExprPurif,2007,55(2):325-333.