人SUMO2基因原核表达、纯化及多克隆抗体制备【论文】

《人SUMO2基因原核表达、纯化及多克隆抗体制备【论文】》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、制备——作者：小小小【摘要】目的：构建人SUMO2基因的原核表达载体，纯化融合蛋白GSTSUM02SUMO2并以其为抗原免疫家兔，制备人SUMO2多克隆抗体。方法：用PCR的方法得到人SUMO2基因并克隆至pET41a(+)原核表达载体中，转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS诱导融合蛋白GSTSUMO2SUMO2表达；所获得的可溶性蛋口经亲和层析纯化、SDSPAGE电泳鉴定后，免疫家兔制备抗血清,分别采用EL1SA>Westernblot检测抗休效价和特异性。结果：测序证实重组质粒pET41a(+)SUMO2SUMO2构建成功；SDSPAGE结果证实获得Mr为5

2、2000的GSTSUM02SUM02融合蛋白且为可溶性蛋白；经过GST亲和层析有效纯化；以该融合蛋白免疫家兔制备得到的抗血清经Westernblot检测证实能与0的蛋门发生特异性结合，ELISA检测为阳性。结论：获得了人SUMO2蛋门及特异性多克隆抗体，对进-步研究人SUMO2及SUMO第二类家族的功能提供了有用工具。【关键词】人SUMO2原核表达蛋白纯化抗血清随着2004年诺贝尔化学奖授予给发现了泛素调节的蛋口质降解的以色列科学家阿龙•切哈诺沃、阿夫拉姆•赫什科和美国科学家欧文•罗斯，近年來，对依赖于泛索及类泛索蛋白的翻译后修饰的研究成为了新的热点。其中，小泛素相

3、关修饰物(smallubiquitinrelatedmodifier,SUMO)与蛋白的共价连接是一种新的广泛存在的翻译后修饰形式，并口在真核细胞的蛋门质修饰小具有重要意义。哺乳动物小发现4利■SUMO分子：按发现顺序称为SUMO1、SUMO2、SUMO3和SUMO4。与泛素类似，SUMO也是通过与靶蛋白的结合起作用的，但与泛索化介导的蛋白酶降解途径不同，SUMO化的结果并不是将蛋白分了降解，而是通过修饰來增强它们的稳定性或者调节其亚细胞定位，以及影响蛋口质的转录活性，从而发挥更加广泛的功能，比如核质转运、细胞周期调控以及信号转导等［1］。口前为止，我们知道的SUM

4、O化修饰的底物还只是一小部分被明确鉴定，而11我们对已知的SUMO化修饰在改变许多蛋白的稳定性、定位、活性等的机理和功能上还存在很多疑问。尤具是对SUMO2/3的具体作用及其与SUMO1在功能上的茅异还知Z甚少，因而我们通过构建SUMO2的原核表达载体，获得GSTSUMO2融合蛋白并进行纯化，由此得到人SUMO2的特异性多克隆抗体，为进一步研究SUMO2的功能及其与家族其他成员的差异打下了良好的基础。1材料和方法1.1材料质粒PET41a(+)、大肠杆菌DH5a、BL21(DE3)plysS(木实验室保存)，pEYPFSUMO2(雷鸣教授惠赠)，新西兰大门兔(体质量

5、2.5〜3.0kg)2只。小量质粒提取试剂盒、DNA纯化回收试剂盒均为博大泰克公司产品；限制性内切酶NocI及XhoI,T4连接酶、TaqDMA聚合酶、pfuDNA聚合酶、标准相对分了质量(Mr)蛋口均购口大连TaKaRa有限公司；1PTG购自北京索莱宝科技有限公司；卡那霉素购自北京抽国生物工程公司;硝酸纤维素膜为徳国Whatman公司产品；小鼠GST单克隆抗体(mAb)、HRP标记的羊抗兔、兔抗鼠抗体购自北京I■専奥森主物技术有限公司；GSTbindcolumn购自Amersham公司；凝血酶购自Sigma公司；其他常'规试剂为国产分析纯试剂。1.2方法1.2.1

6、引物的设计及合成根据GenBcink(GenbankID:NM_006936)中人SUMO2基因cDNA序列，克隆其ORF中活性蛋白区域即其162bp至441bp序列，设计合成两对引物，引物序列如下，第一对上游引物P1:5’CCGCCATGGGAATGTCCGAGGAGAAG3’;下游引物P2:5’TATGGATCCACCTCCCGTCTGCTG3’；其中上游引物含有NeoI限制性酶切位点，下游引物含有BamHI限制性酶切位点。第二对上游引物P3:5’TTCGGATCCATGTCCGAGGAGAAG3’；下游引物P4:5’TATCTCGAGTTAACCTCCCGTC

7、TGCTG3’；其中上游引物含有BamHI限制性酶切位点，卜•游引物含有XhoI限制性酶切位点。另为做重组质粒检测用，又合成了PET41a(+)的通用引物S.Tagprimer#699453(记做Ps):CGAACGCCAGCACATGGACAGCT7terminatorprimer#693373(记做Pt):ACCGCTGAGCAATAACTAGCA引物合成由上海英俊主物工程公司完成。1.2.2人SUMO2基因原核表达载体pET41a(+)SUMO2SUMO2的构建以pEYFPSUMO2质粒为模板，进行常规PCR扩增，扩增条件为：94°C预变性3min,94°