人SUMO2基因原核表达、纯化及多克隆抗体制备【论文】

《人SUMO2基因原核表达、纯化及多克隆抗体制备【论文】》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

制备——作者：小小小【摘要】目的：构建人SUMO2基因的原核表达载体，纯化融合蛋白GSTSUM02SUMO2并以其为抗原免疫家兔，制备人SUMO2多克隆抗体。方法：用PCR的方法得到人SUMO2基因并克隆至pET41a(+)原核表达载体中，转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS诱导融合蛋白GSTSUMO2SUMO2表达；所获得的可溶性蛋口经亲和层析纯化、SDSPAGE电泳鉴定后，免疫家兔制备抗血清,分别采用EL1SA>Westernblot检测抗休效价和特异性。结果：测序证实重组质粒pET41a(+)SUMO2SUMO2构建成功；SDSPAGE结果证实获得Mr为52000的GSTSUM02SUM02融合蛋白且为可溶性蛋白；经过GST亲和层析有效纯化；以该融合蛋白免疫家兔制备得到的抗血清经Westernblot检测证实能与0的蛋门发生特异性结合，ELISA检测为阳性。结论：获得了人SUMO2蛋门及特异性多克隆抗体，对进-步研究人SUMO2及SUMO第二类家族的功能提供了有用工具。【关键词】人SUMO2原核表达蛋白纯化抗血清随着2004年诺贝尔化学奖授予给发现了泛素调节的蛋口质降解的以色列科学家阿龙•切哈诺沃、阿夫拉姆•赫什科和美国科学家欧文•罗斯，近年來，对依赖于泛索及类泛索蛋白的翻译后修饰的研究成为了新的热点。其中，小泛素相关修饰物(smallubiquitinrelatedmodifier,SUMO)与蛋白的共价连接是一种新的广泛存在的翻译后修饰形式，并口在真核细胞的蛋门质修饰小具有重要意义。哺乳动物小发现4利■SUMO分子：按发现顺序称为SUMO1、SUMO2、SUMO3和SUMO4。与泛素类似，SUMO也是通过与靶蛋白的结合起作用的，但与泛索化介导的蛋白酶降解途径不同，SUMO化的结果并不是将蛋白分了降解，而是通过修饰來增强它们的稳定性或者调节其亚细胞定位，以及影响蛋口质的转录活性，从而发挥更加广泛的功能，比如核质转运、细胞周期调控以及信号转导等［1］。口前为止，我们知道的SUMO化修饰的底物还只是一小部分被明确鉴定，而11我们对已知的SUMO化修饰在改变许多蛋白的稳定性、定位、活性等的机理和功能上还存在很多疑问。尤具是对SUMO2/3的具体作用及其与SUMO1在功能上的茅异还知Z甚少，因而我们通过构建SUMO2的原核表达载体，获得GSTSUMO2融合蛋白并进行纯化，由此得到人SUMO2的特异性多克隆抗体，为进一步研究SUMO2的功能及其与家族其他成员的差异打下了良好的基础。1材料和方法1.1材料质粒PET41a(+)、大肠杆菌DH5a、BL21(DE3)plysS(木实验室保存)，pEYPFSUMO2(雷鸣教授惠赠)，新西兰大门兔(体质量2.5〜3.0kg)2只。小量质粒提取试剂盒、DNA纯化回收试剂盒均为博大 泰克公司产品；限制性内切酶NocI及XhoI,T4连接酶、TaqDMA聚合 酶、pfuDNA聚合酶、标准相对分了质量(Mr)蛋口均购口大连TaKaRa有限公司；1PTG购自北京索莱宝科技有限公司；卡那霉素购自北京抽国生物工程公司;硝酸纤维素膜为徳国Whatman公司产品；小鼠GST单克隆抗体(mAb)、HRP标记的羊抗兔、兔抗鼠抗体购自北京I■専奥森主物技术有限公司；GSTbindcolumn购自Amersham公司；凝血酶购自Sigma公司；其他常'规试剂为国产分析纯试剂。1.2方法1.2.1引物的设计及合成根据GenBcink(GenbankID:NM_006936)中人SUMO2基因cDNA序列，克隆其ORF中活性蛋白区域即其162bp至441bp序列，设计合成两对引物，引物序列如下，第一对上游引物P1:5’CCGCCATGGGAATGTCCGAGGAGAAG3’;下游引物P2:5’TATGGATCCACCTCCCGTCTGCTG3’；其中上游引物含有NeoI限制性酶切位点，下游引物含有BamHI限制性酶切位点。第二对上游引物P3:5’TTCGGATCCATGTCCGAGGAGAAG3’；下游引物P4:5’TATCTCGAGTTAACCTCCCGTCTGCTG3’；其中上游引物含有BamHI限制性酶切位点，卜•游引物含有XhoI限制性酶切位点。另为做重组质粒检测用，又合成了PET41a(+)的通用引物S.Tagprimer#699453(记做Ps):CGAACGCCAGCACATGGACAGCT7terminatorprimer#693373(记做Pt):ACCGCTGAGCAATAACTAGCA引物合成由上海英俊主物工程公司完成。1.2.2人SUMO2基因原核表达载体pET41a(+)SUMO2SUMO2的构建以pEYFPSUMO2质粒为模板，进行常规PCR扩增，扩增条件为：94°C预变性3min,94°C变性30s、55°C复性30s、72°C延伸30s、30个循环后，72°C延伸6min终止反应。取PCR产物用10g/L琼脂糖凝胶进行电泳，用凝胶成像仪检测电泳结果。将回收纯化的SUM02第1对PCR产物和原核表达载体pET41a(+)分别用Neo1和BamH1酶切后，从琼脂糖凝胶回收pET41a(+)片段和PCR产物片段，T4连接酶连接(4°C,过夜)用含卡那霉素的抗性培养基筛选，构建重组质粒pET41a(+)SUMO2。同样方法，将冋收纯化的SUMO2第二对引物扩增的PCR产物和已构建好的重组质粒pET41a(+)SUM02分别用BamHT和XhoT酶切后，T4连接酶连接(4°C,过夜),用含卡那霉素的抗性培养基筛选，构建重组质粒pET41a(+)SUM02SUM02,其N端与GST标签形成融合蛋白。1.2.3大肠杆菌转化及重组质粒的鉴定制备超级感受态DH5a和BL21(DE3)pLysS细胞，转化重组质粒pET41a(+)SUMO2和pET41a(+)SUMO2SUMO2。挑取转化菌落培养，提取质粒分别经NeoI、BamHI双酶切和血mHI、XhoI双酶切以及pET41a(+)的通用引物Ps和Pt进行PCR检测，鉴定载体屮是否插入口的基因。含口的基因的重组质粒由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。1.2.4融合蛋口GSTSUM02SUM02的诱导表达将测序止确的GSTSUM02SUM02重组质粒转化表达菌株BL21(DE3)pLysS,选取阳性克隆 于液体LB培养基屮37°C振荡培养至A600二1.0时，加入1PTG至终浓度1minol/L,在28°C下诱导5h后收获菌液。离心收集细菌，用SDSPAGE鉴定蛋白。1.2.5融合蛋白GSTSUMO2SUMO2的纯化将诱导表达的1000mL菌体培养液4°C,10000g,10min离心收集菌体，弃上清，反复冻融法裂解细菌，依次加入20mLPBS缓冲液，0.2mLTritonX100及0.2mL蛋白酶抑制剂PMSF完全融化和重悬冰冻细胞沉淀，待细胞裂解完全后加入DNAase和RNAaseo在变性条件下(加DTT至终浓度1mmol/L)按公司GST亲和层析柱试剂盒的操作方法进行表达融合蛋口的纯化，-70°C储存备用。1.2.6多克隆抗体的制备及纯化按常规方法免疫家兔。首次免疫吋，按每只1mg的剂量，将纯化得到的GSTSUM02SUM02溶于PBS(终浓度为2g/L)屮，加入等体积的弗氏完全佐剂，充分乳化后背部皮下及腹股沟多点注射；每点W100UL乳化抗原。加强免疫，抗原用量同初次免疫，加弗氏不完全佐剂，丁，前次免没后的2周进行。最后1次加强免没后的10d后放血，取血清。免疫血清用蛋口A亲和层析柱进行纯化，-20°C保存。1.2.7多克隆抗体鉴定(l)Westernblot鉴定：将BL21(DE3)pLysS表达产物经SDSPAGE电泳后，采用电转移(60V,2h)将蛋白条带转移到硝酸纤维素膜QC膜)上，TBS洗涤1次，然后用50g/L脱脂奶粉封闭1h,TBS洗涤3次，TTBS洗涤1次，加入纯化后的兔抗SUMO2多克隆抗体4°C过枚，TBS洗涤3次，TTBS洗涤1次，然后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗室温温育1h,TBS洗涤3次，TTBS洗涤2次，DAB显色液显色。(2)ELISA检测：用碳酸盐缓冲液稀释至1mg/L,按照100uL/孔的量包被到聚苯乙烯反应(PVC)板上，4°C过夜包被；用PBST洗涤3次，然后按照20011L/孔的量加入封闭液；用PBST洗涤3次，每孔加入100uL倍比的免疫血清，正常兔血清作为阴性对照，每个样品设2个复孔，37°C孵育2h;用PBST洗涤3次，每孔均加入100nLPBS(含1g/LBSA)稀释的二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，1：4000稀释，博奥森生物技术有限公司公司)，37°C孵育1h;用PBST洗涤3次，加入50uLOPD显色液，室温避光显色10〜15min,用25uL2mol/L的硫酸终止反应；在490nm波长下用酶标仪读数。2结果2.1pET41a(+)SUM02SUM02原核表达载体的构建利用PCR方法，用第1对引物P1/P2从pEYPFSUMO2质粒中扩增出302bp大小的DNA片段，与预期Mr大小相符(图1A1)o以Neo1/BamHI分别双酶切PCR产物和质粒pET41a(+),T4连接酶连接2者酶切回收后产物(4°C,过夜),连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态后，挑单克隆，B型质粒快速提取试剂盒法提取质粒pET41a(+)SUMO2。同样方法，用第2对引物P3/P4从pEYPFSUMO2质粒中扩增出300bp大小的片段(图1A2),以BamHI/XhoI分别双酶切PCR产物和质粒pET41a(+)SUM02,4°C过夜连接，转化得重组质粒pET41a(+)SUM02SUM02。 2.2pET41a(+)SUM02SUM02原核表达载休的鉴定用Neo1、BamH1双酶切及pET41a(+)的通用引物Ps和Pt进行PCR检测pET41a(+)SUMO2,其中PCR结果为pET41a(+)载体本身部分片段+SUMO2插入片段共计487bp,酶切结果为上方5.9kb,下方300bp(图IB)o用NeoI、XhoT双酶切及pET41a(+)的通用引物Ps和Pt进行PCR检测pET41a(+)SUM02SUM02,其中PCR结果为pET41a(+)载体本身部分片段+SUM02SUM02插入片段共计775bp,酶切结果为上方5.9kb,下方602bp(图1C)o将酶切及PCR检测结果阳性的质粒pET41a(+)SUM02SUM02中目的基因序列测序。结果表明，目的基因SUM02SUM02正确插入pET41a(+),并保持正确的读码框架。图1重组质粒PCR及双酶切鉴定(略)Fig1RestrictivemeippingandPCRofrecombinantplasmidpET41aSUM02SUM02A:M:DL2000marker;1,2:PCRofSumo2byP1/P2andP3/P4.B:1:PCRofPET41aSumo2byPs/Pt;M:DL2000marker;2:RestrietivemappingofPET41aSumo2byNeo1,BamHI.C:1:PCRofPET41aSumo2Sumo2byPs/Pt;M:DL2000marker;2:RestrictivemappingofPET41aSumo2Sumo2byNeoI,XhoI.2.3IPTG诱导目的蛋白的表达按前述方法进行目的蛋白GSTSUM02SUM02的诱导表达，经过不同的IPTG诱导浓度、诱导时间和诱导温度的筛选(数据未列出)，在终浓度1mmol/L的IPTG,28°C诱导5h后蛋白产量达到高峰。收获的菌液屮有Mr约51900左右的GSTSUM02SUM02蛋白，而未诱导的BL21(DE3)pLysS大肠杆菌菌液中未见此蛋白表达(图2)。2.4融合蛋白的纯化及凝血酶酶切鉴定用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析纯化GSTSUM02SUM02融合蛋白(图3A),第2泳道为菌体裂解液离心后的上清液即可溶性蛋白，目的蛋白的表达基木上是以可溶蛋白为主。第1泳道Mr约52000且条带单一，说明纯化效果很好而且正确。将融合蛋门GSTSUM02SUM02经凝血酶酶切后SDSPAGE电泳检测蛋白(图3B)。其中第3、4泳道为酶切过后的融合蛋口，都在Mr26000和36000处显示两条带(箭头所示)，分别为酶切后的GST和人SUM02SUM02蛋白片段，说明融合蛋白表达正确。图2GSTSUM02SUM02融合蛋白的表达(略)Fig2SDSPAGEofthecxprcssionoffusedprotoinGSTSUMO2SUMO21:pET41a(+)BL21(DE3)PlysSwithoutinduction;2:pET41a(+)BL21(DE3)PlysSintroducedby1mmol/L IPTG;3:pET41a(+)SUMO2BL21(DE3)PlysSwithoutinduction;4:pET41a(+)pET41a(+)pET41a(+)IPTG;M:SUM02BL21(DE3)PlysSintroducedby1mmol/LIPTG;5:SUM02SUM02BL21(DE3)PlysSwithoutinduction;6:SUM02SUM02BL21(DE3)PlysSintroducedby1mmol/LProteinLMWmarker・图3融合GSTSUMO2SUMO2的纯化及酶切验证（略）Fig3SDSPAGEannlysisoffusionproteinGSTSUMO2SUMO2A:M:ProteinLMWmarker;1:FusionproteinGSTSUM02SUM02purifiedbyaffinitychromatography;2:Thesupernatantofcel1lysate,namelysolubleprotein;3:Totalprotein.B:M:ProteinLMWmarker;1:Thrombin;2:PurifiedfusionproteinGSTSUMO2SUMO2;3,4:PurifiedGSTSUMO2SUMO2digestbythrombin.2.5多克隆抗体活性检测（1）ELISA检测：以纯化后的SUMO2蛋白为包备抗原，间接ELISA法测定人SUMO2多克隆抗体效价（图4）,结果表明经4次免疫后，抗休效价约为1：40000o（2）Westernblot检测：将纯化的融合蛋白以及经酶切后的GSTSUM02SUM02电泳后转膜，分别用兔抗鼠GSTmAb和制备的兔抗人SUMO2多克隆抗体作为一抗进行Westernblot鉴定，结果如图5所示。两图在Mr52000和26000处都检验出条带，应分别为GSTSUM02SUM02和GST蛋门，而A图（IB:兔抗人SUM02多克隆抗体）还在Mr36000左右处（如箭头所示）检验出条带，为抗体识别的SUM02SUM02蛋白。图4EL1SA法测定人SUM02多克隆抗体效价（略）Fig4Determinationofantibodytiterapplying图5Westernblot鉴定抗人SUM02多克隆抗体特异性(略)ofpolyclonalantibodytoHomoSUM02Fig5ThespecificitydetectedbyWesternblotA:AntiSumo2;B:AntiGST.M:ProteinLMWmarker;1:PurifiedGSTSUM02SUM02digestedbythrombin;2-4:PurifiedGSTSUM02SUM02・3讨论与蛋白质泛素化过程类似，SUMO化过程也需要其特异性蛋白酶切掉C末端双廿氨酸(GlyGly)后的氨基酸残基助其前体成为活化形式，然后在El、E2和E3(E3是否一定需要尚不明确)[10]作用下结合到靶蛋白上。其屮，SUMO2的开放阅读框(ORF)为其全长cDNA的162〜473bp,在木实验中，为了在后续实验中研究SUMO2功能的便利，因而直接克隆其活性蛋口区，即162〜441bp,也就是表达终止在其双甘氨酸(GlyGly)处，为SUM02 GG,这样就保证了我们克隆区域的蛋白表达产物即使在没冇外加SUMO蛋口酶的情况下也可以完全行使其生物学功能。与泛素类似，SUMO2也屈于小分子蛋白，其氨基酸残基仅为90多个，这在抗休制备过程中就带来了难题，因为其分了量太小就必然导致其免疫原性的降低，因而所得到的抗体很可能效价不高。所以在木实验中，我们大胆提出了抗原串联的方法，即在表达载体pET41a(+)的多克隆位点处连续插入2个SUMO2片段，以串联形式构成融合蛋nGSTSUM02SUM02,这样就大大提高了抗原的免疫原型，这一点从我们的RLTSA检测中可以看出，我们通过该方法所制得的人SUMO2多克隆抗体得到了比较满意的效价结果。SUMO在行使功能的过程屮，是否一定需要E3还未确定，其至在一段时间以前，连是否存在E3都有过争议，直到近儿年在酵母和哺乳动物中陆续发现三种E3连接酶，才平息了这种争议。值得注意的是，已发现的几种E3连接酶都与特殊的亚细胞结构有关，而在已经研究的比较清楚的SUMO家族的部分功能中，调节靶蛋白的亚细胞定位是其一项重要功能，在我们对SUMO家族进行进一步研究的时候，利用免疫染色、免疫印记等技术时就必须要有高效价、特异性的SUMO蛋白抗体，而现在的国内国际市场，相关产品却十分罕见,因而我们通过串联抗原方法所制得的高效价的SUMO2蛋口特异性多克隆抗休，为SUMO2的进一步研究打下良好的基础。【参考文献】VergerA,PerdomoG,CrossleyM.ModificationwithSUMOAroleintranscriptionalregulation[J].EurMolBiolOrg,2003,4(2):137-142.SaitohH,HincheyJ・Functionalhctcrogencityofsmallubiquitinrelatedproteinmod辻icrsSUMO1versusSUMO2/3[J]・JBiolChem,2000,275(3):6252-6258.TathamMH,JaffrayE.Vaughan0A,etal.PolymericchainsofSUMO2andSUMO3areconjugatedtoproteinsubstratesbySAE1/SAE2andUbc9[J].JBiolChem,2001,276(2):35368-35374.MullerS,IlocgcC,PyrowolakisG,ctal.SUMO,ubiquitin'smysteriousconsin[j]・NatRevMolCellBiol,2001,2(4):202-203・HayRT.ProteinmodificationbySUMO[J]・CurrBiol,2003,13(5):R258-R259.陈泉，施蕴渝.小泛素相关修饰物SUMO研究进展[J]•生命科学,2004,16(1):1-6.Gil1G.SUMOandubiquitininthenucleus:Differentfunctions,similarmechanisms?[J]・GeneDev,2004,18(2):2046-2059. 叶晓峰，吴乔.类泛索蛋白SUMO[J]・细胞生物学杂志，2004,26(1):10-14.HilgarthRS,MurphyLA,SkaggsHS,elal.RegulationandfunctionofSUMOmodification[J].JBiolChem,2004,279(52):53899-53902.吕素芳，刘峥，郭广君，等.大肠杆菌屮表达外源重组蛋白的研究[J]・科学技术与工程，2006,6(7):2872-2876.KroetzMB.SUMO:Aubiquitinlikeproteinmochfier[J].YaleJBiolMed,2005,78(4):197-201.LiTW,SantockytcR,ShenRE,ctal.ExprcssionofSUMO2/3inducedsenescencethroughp53andpRBmediatedpathways[J]・JBiolChcm,2006,281(47):36221-36227.