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《qki蛋白的原核表达、 纯化及其多克隆抗体的制备与鉴定论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、QKI蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备与鉴定论文.freelory大学药理系教授冯越惠赠。Ni金属鳌合柱（SepharoseFastFloacia公司。纯种新西兰白兔由本校实验动物中心提供。弗氏佐剂购自GibcoBRL公司。HepG2细胞、Hy906细胞为本室保存的引自美国ATCC的标准细胞株。1.2方法1.2.1细菌的发酵和裂解将6×His融合表达载体PET32b(+)QKI7转化的大肠杆菌BL21(DE3)接到5mL的LB培养基中,30℃培养过夜,转接细菌到500mL2×YT培养基中,30℃培养10h无
2、菌接种于30L发酵罐中（内有8L培养液,不含抗生素）37℃培养6h后开始流加补料,9h后加入IPTG至终浓度05mmol/L开始诱导,诱导4h后停止发酵。4000r/min离心25min,收集沉淀,-70℃保存备用。取发酵细菌,按照细菌和裂解液为1∶8的比例加入裂解(20mmol/LTrispH10,3mL/L巯基乙醇,6mol/L盐酸胍),不停搅拌,室温过夜。8000r/min离心30min,收集上清;然后用超声波发生器以1500r约40000的蛋白带(图1),与预期的6×HisQKI7融合蛋白Mr相符。经金属鳌
3、合柱（图2）,反相层析柱（source30RPC）（图3）,强阴离子柱（source30Q）（图1）层析法纯化的上述蛋白,在SDSPAGE后几乎为单一条带,纯度达到95%以上。图16×HisQKI7融合蛋白的诱导表达和纯化（略）1:未用IPTG诱导;2:IPTG诱导4h;3:纯化的6×HisQKI7.图26×HisQKI7融合蛋白经金属鳌合柱后纯化结果（略）1:金属鳌合柱层析产物;M:蛋白marker.图36×HisQKI7融合蛋白经反相层析柱纯化结果（略）1:反向层析柱柱层析物;M:蛋白marker.2.2抗原的
4、鉴定将未诱导细菌的裂解产物和最终纯化的目的蛋白产物作r约40000的蛋白带反应,与QKI5的Mr相符。2.4所获得抗体对内源性抗原的检测用弗氏佐剂组所产生的抗QKI多克隆抗体（1∶1000稀释）对Hy906细胞的蛋白提取物做r约40000的蛋白带反应,与QKI5的Mr相符（图6）。说明我们所获得的QKI多克隆抗体能检测内源性抗原的表达。图5抗QKI多克隆抗体的olCellBiol,1998,18:4863-4871.3CoxRD,HugillA,ShedlovskyA,etal.Contrastingeffects
5、ofENUinducedembryoniclethalmutationsofthequakinggeneJ.Genomics,1999,57:333-341.4PilotteJ,LarocqueD,RichardS.NucleartranslocationcontrolledbyalternativelysplicedisoformsinactivatesthequakingapoptoticinducerJ.GenesDev,2001,15:845-858.5张莹莹,李福洋,张文红,等.一种新的丝氨酸蛋白酶ESP
6、30的表达及其多克隆抗体的制备J.细胞与分子免疫学杂志,2005,21(3):334-336.6MezquitaJ,PauM,MezquitaC.FourisoformsofthesignaltransductionandRNAbindingproteinQk1expressedduringchickenspermatogenesisJ.MolReprodDevel,1998,50:70-78.7刑小红,吴元明.兔抗人Bit1抗血清的制备及其纯化J.细胞与分子免疫学杂志,2004,20（6）:764.
