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《Snail／GST融合蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、专科办学点教育技术专业课程培养方案思考《国家中长期教育改革和发展规划纲论文联盟要》指出,“信息技术对教育发展具有革命性影响，必须予以高度重视”，“提高教师应用信息技术水平，更新教学观念，改进教学方法，提高教学效果。鼓励学生利用信息手段主动学习、自主学习，增强运用信息技术分析解决问题能力。”随着教育信息化进程的推进，培和方法主要试剂和菌株主要试剂购自北京中山公司；大肠杆菌DH5a和BL21由北京大学临床肿瘤学院北京市肿瘤防治研究所细胞实验室保存。pGEX4T1/Snail原核表达载体的克隆从人血管内皮细胞提取总RNA,在逆转录酶作用下，合成cDNAo以逆转录的cDNA为模板
2、，用上游引物5’CTGCAGGACTCTAATCCAG3'和下游引物5’ATCCTTGGCCTCAGAGAGC3’,进行PCR扩增，得到SnailC末端377bp的DNA片断；酶切、琼脂糖凝胶电泳分离后，用玻璃奶法纯化回收，与pGEX4T1原核表达载体定向连接。转化DH5a感受态细菌，提取质粒并酶切鉴定重组体。融合蛋白的诱导表达与纯化表达鉴定表达质粒Snai1/pGEX4T1转化大肠杆菌DH5a后，经过酶切鉴定，挑取阳性细菌克隆至3mlLB/Amp+试管中培养3〜5h。SDSPAGE分析融合蛋白的诱导表达情况。可溶性鉴定离心诱导菌液，收集菌体，以PBS重悬，加细菌裂解液混
3、匀，冰浴。加入TritonX100至终浓度为1%,冰浴。冰上以20Hz间歇超声裂解。再离心并分别收集上清和沉淀，进行SDSPAGE,证实融合蛋白以包涵体形式存在。纯化加5倍体积超声缓冲液悬浮沉淀，冰上间歇超声30s,离心弃上清。重复3〜4次。沉淀加等体积SDSPAGEloadingbuffer,超声重悬，沸水煮5min后上样，100V电泳6〜7h。用冷浸泡胶，切下目的条带放入透析袋内。将透析袋置于水平电泳洗脱装置内，60V洗脱过夜，次日100V继续洗脱lh,然后反转电极向相反方向洗脱3〜5mino吸出透析带内液体，蔗糖包埋浓缩，PBS透析。行SDSPAGE定量，即获得纯化
4、的融合蛋白。抗Snail多克隆抗体的制备抗原为原核表达并经SDSPAGE胶纯化的GST/Snai1融合蛋白，免疫新西兰白兔。取耳血，用ELISA法测定抗体效价，当效价达到10-5时，放血，收集血清。抗体效价和特异性免疫学鉴定酶联免疫吸附实验检测抗体滴度：观察结果并用ELISAReader测0D490nmoWesternBlot鉴定抗体SDSPAGE分析融合蛋白的诱导表达情况。2结果Sna订/pGEX4T1原核表达载体的构建和鉴定结果以Snail全长为模板，PCR大量扩增出Snail片段，经鉴定在约400bp处有条带扩出，与推算值相符；将目的片段装入pGEX4T1原核表达载
5、体后，酶切鉴定正确，在近400bp处有条带释放。融合蛋白GST/Sna订的诱导表达和纯化经纯化的GST/Sna订融合蛋白只有一条蛋白带。2.3Sna订多克隆抗体活性鉴定ELISA鉴定经制备型SDSPAGE进一步纯化的融合蛋白GST/Snail免疫新西兰兔获得抗血清，ELISA实验结果表明，其效价为5X105oWesternBlot鉴定抗体Snail/pGEX4T1感染的细胞在近40KD处出现条带。3讨论本课题通过基因工程手段原核表达Snail竣基端的GST融合蛋白[3],然后免疫新西兰兔获得效价高、特异性强的抗Sna订抗体，与一些进口抗体相比造价低，且适用于免疫荧光、石蜡
6、切片等[4],为深入研究其功能和探讨其与肿瘤等疾病的相关性提供了工具。我们利用该抗体研究了宫颈不同组织学阶段的蜡块标本，Snaill表达的免疫组织化学反应在宫颈癌中呈上升趋势，阳性表达率为％,与正常及非典型增生组差别明显，证明Snail与癌分化程度相关。表明了Sna订是肿瘤进展过程中浸润的一个重要的调节因素[5],为今后进一步揭示肿瘤的浸润和转移开创了新的途径和工具。【参考文献】[1]CanoA,PerezMorenoMA,etal.Thetranscriptionfactorsnailcontrolsepithelialmesenchymaltransitionsbyr
7、epressingEcadherinexpression[J].NatCellBiol,2000,2(2):7683・[2]ComijnJ,BerxG,VermassenP・MechanismsofinactivationofEcadherininbreastcarcinoma：modificationofthetwohithypothesisoftumorsuppressorgene[J].MolCell,2001,7(6):12671278.[3]BolosV,PEinadoH,PerezMorenoMA,etaLThet
