小麦tawrky9基因的原核表达及多克隆抗体制备

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1、分类号学号M201371620学校代码10487密级硕士学位论文小麦TaWRKY9基因的原核表达及多克隆抗体制备学位申请人：荣肖丽学科专业：生物工程指导教师：何光源教授答辩日期：2015年5月17日AThesisSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofEngineeringProkaryoticexpressionofwheatTaWRKY9geneanditspolyclonalantibodypreparationCa

2、ndidate：RongXiaoliMajor：BiologicalEngineeringSupervisors：Prof.HeGuangyuanHuazhongUniversityofScienceandTechnologyWuhan,Hubei430074,P.R.ChinaMay,2015独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中

3、以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本授权书。本论文属于不保密□。（请在以上方框内打“√”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日华中

4、科技大学硕士学位论文摘要小麦是人类必不可少的粮食作物之一。干旱、低温、高盐等非生物胁迫和微生物致病体、昆虫进食等生物胁迫严重影响了小麦的生长发育和产量，因此，提高小麦对生物胁迫和非生物胁迫的抗性具有非常现实的意义。在恶劣的外界环境下，植物的生理生化过程会发生一些改变，其中WRKY转录因子起到了重要的调控作用。它不但参与植物生长发育和新陈代谢过程，而且还参与了植物应对外界生物以及非生物的胁迫反应。小麦WRKY转录因子可调控抗病相关基因、损伤诱导基因和衰老相关基因的表达。因此，研究WRKY基因可为抗性小麦育种提供理论基础

5、。在先前的研究中，已经得到了在DNA水平和RNA水平上鉴定为阳性的TaWRKY9转基因烟草植株，但还未在蛋白质水平上得到鉴定。本课题首先培育中国春小麦（Triticumaestivum.Lcv.ChineseSpring）幼苗，提取小麦RNA，反转录成cDNA后设计合适的引物、PCR反应体系和程序克隆得到TaWRKY9基因，测序正确后将TaWRKY9基因与表达载体pET32a相连，构建原核表达载体，将构建好的质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）中进行原核表达，通过摸索OD600值、IPTG终浓度、温度等几个条件，成功诱

6、导出分子量为67.93kDa的目的蛋白，然后进行可溶性检测发现目的蛋白为包涵体蛋白，用含有尿素的变性A溶液将目的蛋白成功提取，最后通过胶回收将目的蛋白进行纯化后浓缩到一定浓度，即可作为抗原送到武汉病毒所免疫新西兰兔得到多克隆抗体，最终用制备的抗体进行Western-blot检测证明该抗体可以在蛋白质水平上验证TaWRKY9转基因烟草植株，从而为进一步研究该基因的生物学功能奠定基础，也能够为研究转基因小麦的抗逆功能提供依据。关键词：小麦，TaWRKY9基因，原核表达，多克隆抗体，Western-blotI华中科技大学硕

7、士学位论文AbstractWheatisoneofthemostessentialcropsintheworld.However,abioticstresseslikedrought,lowtemperatureandhighsalinity,bioticstresseslikemicrobialpathogensandharmfulinsectsaffectthegrowthandyieldofwheatseriously.Therefore,itisimportanttoimprovewheatbioticstr

8、essandabioticstressresistance.WRKYtranscriptionfactorsplayakeyroleinthephysiologicalandbiochemicalresponsesofplantsundertheharshexternalenvironment.WRKYtranscriptionfactorsi