鲤鱼CD74同源基因的原核表达及多克隆抗体制备.pdf

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1、一28一江苏农业科学2012年第40卷第3期陶乐，蔡国平．鲤鱼CD74同源基因的原核表达及多克隆抗体制备[J]．江苏农业科学，2012，40(3)：28—3t鲤鱼CD74同源基因的原核表达及多克隆抗体制备陶乐，蔡国平(1．清华大学生命科学学院，北京100084；2．清华大学深圳研究生院生命学部，广东深圳518055)摘要：通过PCR扩增出鲤鱼CD74同源基因的胞外片段trcIclpl和trcIclp2，将其克隆到原核表达载体pQE一30中，并在大肠杆菌菌株M15中经IPTG诱导表达，经过变性，Ni—NTA柱亲和纯化，透析复性，

2、得到可溶性纯化蛋白。将纯化后的蛋白免疫NIH小鼠制备多克隆抗体，经Western鉴定，ELISA法测其效价分别高达1：51200和1：12800。关键词：鲤鱼；CD74基因；原核表达；多克隆抗体中图分类号：Q959．4文献标志码：A文章编号：1002—1302(2012)03—0028—03近年来，我国水产养殖业发展迅速，鱼类病害防治问题也马鱼]、虹鳟、鲤鱼、黑鲈等物种中克隆到它的同日趋突出。传统的病害防治仍以化学合成药物和抗生素为源基因。然而这些工作仅局限在基因鉴定和mRNA表达分主，但容易引发耐药性、药物残留和环境污染等问

3、题，严重影析的层面，鲜有关于免疫功能和分子机制的研究。本研究旨响食品安全和公众健康。因此，开发替代技术迫在眉睫。目在构建原核表达载体，体外表达鲤鱼CD74同源基因的2个前，国际国内研究进展主要集中在2个方向：一是筛选鱼类免蛋白产物Iclpl和Iclp2的胞外截短型片段trclclpl和trcI．疫增强剂，提高自身非特异性免疫能力；二是研发鱼用疫clp2，并以此为抗原制备鼠源多克隆抗体，为进一步探索硬骨苗。。显然这些免疫预防技术的发展亟需对鱼类免疫机理鱼类免疫机理提供工具。进行深入研究。1材料与方法CD74基因编码一类Ⅱ型跨膜糖

4、蛋白，又名恒定链(invar—iantchain，Ii)，是抗原呈递过程的重要参与者，在调控Ⅱ型主1．1材料要组织相容性复合体(classI1majorhistocompatibilitycon—1．1．1供试材料鲤鱼(CyprinuscarpioL．)购于深圳市南山plex，MHCII)的表达和功能方面起关键作用一。cD基区西丽镇水产市场；雌性NIH小鼠购于广东省实验动物中因的功能在鼠和人中研究得比较广泛，已分别将其定位于鼠心；原核表达载体pQE一30为本实验室保存；原核表达用菌第l8号染色体和人第5号染色体J。Ii蛋白在内

5、质网中E．coliM15为本实验室保存。形成同源三聚体，然后与3个MHCI10异源二聚体结合1．1．2试剂TRIzol试剂购于Invitrogen公司；第1链eDNA成九聚体。Ii蛋白的MHCII关联肽结构域(MHCclasslI合成试剂盒、mesTARItMDNA聚合酶、DNA连接试剂盒、—associatedpeptide，CLIP)与MHC11复合体的肽结合槽结DNAMarkerDL2000、DNA胶回收试剂盒、限制性内切酶合，防止其在内质网错误的结合胞内肽。Ii携带的特殊信BamHI和HindⅢ购自宝生物工程(大连)有

6、限公司；Ni—号还能控制Ii—MHCⅡ复合物的分选，使其到达胞内体，在NTA亲和柱产自QIAGEN公司；SnakeSkinTM透析袋产自那里与含有外源蛋白的溶酶体融合，然后Ii被蛋白酶降解，Thermo公司；Bradford蛋白浓度测定试剂盒、TMB显色液、His在一种类MHCI1分子HLA—DM的帮助下，外源多肽取代—Taq抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗购自碧云天生CLIP片段占据MHCII肽结合槽。这样MHClI到达细物技术研究所；蛋白预染Marker产自Fermentas；ECL检测试胞表面就可以向T助细胞呈递外源多

7、肽，激活下游免疫反应。剂盒产自KPL公司；完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂购自以研究较为充分的人Ii为例，一个CD74基因由于选择性剪Sigma公司。切和翻译起始产生4种不同分子量的蛋白p33／p35和1．2方法p41／043，前二与后二者区别是1个编码甲状腺球蛋白(thyro．1．2．1总RNA提取及cDNA合成取鲤鱼头肾组织，液氮globulin，Tg)的外显子被剪切。中研磨之后按TRlzol试剂说明书提取总RNA，测∞／关于CD74基因的研究除了具有理论上的意义，还有很D检测纯度和浓度，按第1链合成试剂盒合成eDNA。大的实

8、用价值。比如，已有报道利用CLIP占据MHCII肽结1．2．2引物的设计与合成用Premier5分析GenBank上报合槽的特性，开发疫苗，用T细胞表位替换Ii蛋白的CLIP片道的跨膜蛋白Iclpl和Iclp2的cDNA序列(AB098609．1)和段。近年来，除了人和鼠之外