小鼠b7h4原核表达载体的构建、表达及多克隆抗体的制备

小鼠b7h4原核表达载体的构建、表达及多克隆抗体的制备

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1、小鼠B7H4原核表达载体的构建、表达及多克隆抗体的制备:肖德乾,肖欢,胡国艳,那志萍,郑淑华,刘伟,张良清,徐军发【摘要】目的探讨小鼠B7H4原核表达载体的构建、表达及多克隆抗体的制备。方法采用特异性引物扩增小鼠B7H4(mB7H4)胞外功能区DNA,经酶切、拼接构建原核表达载体pET28amB7H4。将构建的重组表达质粒转化入E.coliBL21(DE3)菌株,采用IPTG诱导表达、NiNTA柱亲和层析纯化目的蛋白、SDSPAGE分析蛋白纯度。将纯化的目的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并对其进行纯

2、化及鉴定。结果序列测定证实了构建的pET28amB7H4重组表达载体含有mB7H4编码序列,其序列分析与GenBank中公布序列对比一致,质粒在E.coli中诱导表达相对分子质量(Mr)为26.5KD的目的蛋白,SDSPAGE分析表明纯化后的目的蛋白达到电泳纯。双向琼脂扩散法检测抗体效价为1∶16,ELISA法检测抗体效价为1∶12800,ethodsMurineB7H4(mB7H4)geneplifieders.ThePCRproductesandthenligatedtoreconstructre

3、binantprokaryoticexpressionvectorpET28amB7H4thatexpressesthemouseB7H4and6Hisfusionprotein.TheexpressionvectoredintoE.coliBL21(DE3)andinducedB7H4fusionproteinthatandanalyzededthatthisrebinantexpressionvectorcontainedmB7H4codingsequencethatidexpresseda26.5

4、kDprotein.Afterpurified,theresultedproteinonstratedthattheantimB7H4antibodyboundspecificallytomB7H4.ConclusionTheprokaryoticexpressionvectorandtheantiserumformB7H4  B7H4(B7x,B7S1)是T细胞活化的共抑制分子(coinhibitor),其mRNA广泛表达于淋巴样和非淋巴样组织(如肺、睾丸、胰腺、前列腺),但其蛋白质在各种组织中不表

5、达或低表达,而在树突状细胞(DC)、单核细胞、巨噬细胞、B细胞和T细胞表面诱导性表达[14]。跨膜型B7H4和可溶性B7H4Ig融合蛋白均可抑制T细胞活化[15],提示B7H4可能在维持机体自身耐受方面起重要作用。目前,国内对B7H4基因原核表达的研究相对较少,我们在克隆了小鼠B7H4(mB7H4)基因的基础上[6]构建表达mB7H4His融合蛋白的原核表达载体pET28amB7H4,并制备兔抗mB7H4多克隆抗体,为进一步研究B7H4的生物学功能奠定了基础。  1材料和方法  1.

6、1动物、质粒和菌株  大肠杆菌DH5a和BL21(DE3)均为本实验室保存。pGEMTmB7H4载体由本实验室构建[6],pET28a(+)表达载体购于Novagen公司。成年新西兰家兔(2kg/只)由广东医学院实验动物中心提供。  1.2试剂  质粒抽提和胶回收试剂盒购自Invitrogen(上海)公司,限制性内切酶购于NEB公司,T4DNA连接酶购自Promega公司,Taq酶购于TaKaRa生物工程公司,DNAMarker和蛋白质Marker购于天根生化科技有限公司,镍离子金属螯合柱(NiNTA)购自

7、Invitrogen(美国)公司,HRP标记的羊抗兔IgG购自北京博奥森生物技术公司,PVDF膜为美国PALL公司产品。DNA合成和测序由Invitrogen(上海)公司完成。常规试剂为国产分析纯。  1.3载体构建  采用PCR技术,自pGEMTmB7H4载体中扩增除mB7H4的胞外段,引物序列为Sense:5'GTTTTCCCATGGGCATTTCAGGCAAGCACTTC3',Antisense:5'GTTTTCCTCGAGGGAGTTCAGCAACTGCAGCTG3',在引物的5'端分别插入

8、NcoI和XhoI限制性内切酶位点,PCR产物长度为699bp。酶切并回收mB7H4PCR产物,同时采用NcoI和XhoI酶切pET28a(+)载体,并将mB7H4连接到pET28a(+)载体中,构建pETmB7H4表达载体,该载体表达mB7H4His融合蛋白,分子量为26.5kD,经酶切和序列测定鉴定pETmB7H4。  1.4重组蛋白的表达  将鉴定正

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