哲罗鲑胰岛素样生长因子ⅱ原核表达、多克隆抗体的制备及组织表达分析

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1、学校代码：10264研究生学号：M120101010上海海洋大学硕士学位论文哲罗鲑胰岛素样生长因子II原核表达、多题目：克隆抗体的制备及组织表达分析ProkaryoticexpressionofHuchotaimenInsulin-likeGrowthFactor-II、PreparationofIts英文题目：PolyclonalAntibodyandTissueDistributioninHuchotaime专业：水产养殖研究方向：繁殖生理学姓名：吴秀梅指导教师：尹家胜二O一五年六月一日上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师

2、的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不

3、保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注答辩地点答辩日期上海海洋大学硕士学位论文哲罗鲑胰岛素样生长因子II原核表达、多克隆抗体的制备及组织表达分析摘要在鱼类胚胎发育过程中，胰岛素样生长因子-II（insulin-likegrowthfactors-II，IGF-II）起着关键的作用。哲罗鲑（Huchotaimen）是鲑科鱼类中最大的个体，其细嫩的肉质、鲜美的味道具有很高的食用与经济价值，目前国内还没有关于哲罗鲑的IGF-II基因的研究。本研究根据GenBank里收录的鲑鳟鱼IGF-II基因序列设计引物P1、P2

4、，以哲罗鲑肝脏RNA提取物为模板，利用RT-PCR方法扩增出哲罗鲑IGF-II基因开放阅读框。首先本研究利用生物学软件对成功克隆出的哲罗鲑IGF-II基因开放阅读框进行了生物信息学分析，其中利用MegAlign软件中默认的ClustalW模式对IGF-II核苷酸序列与氨基酸序列进行同源性分析。利用DNAMAN翻译获得IGF-II氨基酸序列，利用Protean软件进行IGF-II蛋白分子量及等电点进行了预测，采用Clustalx1.83软件和MEGA5.0软件构建了IGF-II核酸序列系统进化树。其次，本研究根据哲罗鱼IGF-II基因开放阅读框序列，利用Primer软件设计了一对用于做荧光实时定

5、量PCR的引物IGF-II-F、IGF-II-R，利用荧光实时定量PCR方法来检测二龄哲罗鲑IGF-II基因在不同组织中的表达情况。最后本研究将目的基因IGF-II与原核表达载pSUMO连接构建出重组表达载体pSUMO-IGF-II。将该重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta中利用IPTG进行目的蛋白的诱导表达。对包涵体形式存在的原核表达蛋白进行变性/复性后获得较纯的目的蛋白，利用ELISA和MTT方法对目的蛋白进行免疫学活性及生物学活性分析。然后利用有生物活性和免疫活性的目的蛋白免疫小鼠，获得鼠抗血清。利用ELISA方法检测获得的哲罗鲑IGF-II抗体的效价；本研究旨在为哲罗鱼的生长模式和生长

6、繁殖的研究奠定基础。相应的实验结果如下：1.克隆的哲罗鲑IGF-II基因的生物信息学与组织表达分析克隆出的哲罗鲑的IGF-II基因开放阅读框序列经过测序后，用blast和DNAMAN比对分析结果正确后，利用生物信息学软件对目的片段进行分析，结果显示哲罗鲑IGF-II基因的长度为645bp，编码的蛋白质含有214个氨基酸残基，I上海海洋大学硕士学位论文该蛋白质的相对分子量为24.554kDa，等电点为9.92；哲罗鲑IGF-II前肽由信号肽、B、C、A、D、E六部分构成；同源性比对和系统进化分析结果显示，哲罗鲑IGF-II与鲑科鱼类IGF-II同源性最高，其中与大西洋鲑的IGF-II同源性最高（

7、98%），该基因在进化的过程中有着高度保守的进化特性；荧光定量PCR实验结果显示，该基因在肝脏中的表达量最高，在心、鳃、脾、后肠、头肾、胃中次之，而在前肠和脑中的表达量最低。2.哲罗鲑IGF-II基因的原核表达、活性鉴定与抗体制备将测序结果正确的目的片段与原核表达载pSUMO连接，经PCR和BsaI和BamHI双酶切验证成功构建出重组表达载体pSUMO-IGF-II，将重组质粒转化到表达菌株Ros