肺表面活性物质相关蛋白c和a原核表达载体的构建、表达及纯化

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1、硕士学位论文肺表面活性物质相关蛋白C及A原核表达载体的构建、表达及纯化硕士研究生：王静指导教师：王斌副教授摘要研究背景肺表面活性物质(pulmonarysurfactant，PS)是由磷脂和蛋白质组成的一种具有高度表面活性的复合物，磷脂含量为85％．90％，蛋白质含量为8％．10％。存在于被覆肺泡表面的液体中，其结合的特异性蛋白为肺表面活性物质相关蛋白，共有4种，小分子疏水性肺表面活性蛋白B与C，分子量分别为6．8KD和3．5KD，大分子亲水性肺表面活性蛋白A与D，分子量分别为28．36KD及43KD。人类肺表面活性物质相关蛋白C(s

2、urfactantassociatedproteinC，SP．C)基因’全长2．4kb，定位于第8号染色体短臂，5个内含子和6个外显子，仅表达于肺泡H型上皮细胞。SP．C基因最初可编码产生含191"--197个氨基酸、分子量为21KD的蛋白质初级产物SP．C蛋白前体。非成熟的SP．C蛋白前体需经过多步复杂的酶解过程才能分化为成熟并具有生理活性的小分子疏水性蛋白SP．C，具有促进磷脂在肺泡表面形成稳定的单分子层，从而降低肺泡表面张力、防止呼气未肺泡塌陷、增加肺顺应性、促进肺间质液体回流及参与肺器官局部防御体系等重要的生理功能。肺表面活性

3、物质相关蛋白A(surfactantassociatedproteinA，SP．A)SP．A基因定位于lO号染色体长臂q21～'q24，核苷酸长度约为4．5Kb，包含两个功能基因SP．AI、SP．A2和一个假基因。SP．A由两种基因编码：SP．A1和SP．A2，94％的核苷酸序列和96％的氨基酸序列相同．SP．A基因最初可编码产生含248．263个氨基酸．SP．A单体是一种糖蛋白，相对分子量为26．38KD，由lI型肺泡上皮细胞和Clara细胞合成和分泌。天然的SP．A由6个SP．A组成并形成一个“花束状”结构。其作用中文摘要包括以下

4、几个方面①参与肺泡表面活性膜的形成和代谢，与小分子肺表面活性物质蛋白B协同，促进表面活性物质板层体转化为管髓体结构，继而参与小分子疏水性肺表面活性物质蛋白B与C扩展管髓体为磷脂单分子层的作用；②通过受体介导，增加肺泡II型上皮细胞摄取脂质，抑制磷脂分泌，稳定细胞内外肺表面活性物质水平，保证肺泡肺表面活性物质含量适当；③肺表面活性蛋白A增加肺泡II型上皮细胞抗氧化能力；④肺表面活性蛋白A与D参与细胞免疫，对免疫细胞(尤其是单核巨噬细胞、中性粒细胞)具有趋化和调理吞噬作用；⑤肺表面活性蛋白A与D调节炎性及过敏反应，抑制T细胞增生，减轻肺过

5、敏性反应或其它毒性物质在肺部的变态反应。胎肺从24周开始有肺表面活性物质蛋白分泌，32．34周达到高峰，SP-A是最先被发现且在肺泡II型上皮细胞中表达最强烈、信号最丰富的蛋白，约占SP总量的50％，与肺成熟度密切相关。SP．A与新生儿呼吸窘迫综合征(NRDS)、成人呼吸窘迫综合征、肺炎、哮喘、肺泡蛋白沉积症(PAP)、特发性肺间质纤维化(IPF)、结节病、肺腺癌、系统性硬化等的发病和转归密切相关。册C基因表达异常可致SP．C蛋白含量、结构变化和功能丧失进而导致新生儿严重的肺间质性疾病、婴幼儿肺间质性疾病如类肉瘤病、弥漫性肺部疾病及部

6、分成人家族性肺纤维化，最后导致呼吸衰竭，这些已经被实验和临床研究所证实。因此寻找一种简便、高效的方法检测SP的含量对于预测与之相关的疾病临床意义重大。目前许多评估肺成熟的方法大部分是以PS为分析对象的。大体可分为生物化学方法和生物物理学方法两类。生物化学方法是定量分析一种或几种表面活性物质成分的绝对量或相对量，包括卵磷脂／鞘磷脂(L／S)测定、磷脂酰甘油(PG)测定、饱和卵磷脂测定等；生物物理学方法是通过评价羊水或痰液中肺表面活性物质成分的肺表面活性或物理效应来判断肺成熟度，包括泡沫振荡实验、荧光偏振评价FLM、分光光度计、LB计数等

7、；卵磷脂／鞘磷脂(L／S)测定、磷脂酰甘油(PG)测定生物化学方法操作复杂，需时长，容易受羊水血性污染的影响，使用受到一定的限制。生物物理学方法除泡沫振荡实验(主观性太强)外，其他均需要特定的仪器设备，且在羊水受到血液或阴道分泌物污染时，准确率Ⅱ硕士学位论文差；由于以上方法的不同缺陷，故目前建立一种非常简便、准确，可被大家广泛接受并应用的肺成熟度检测方法，仍是探索的热点。SP．A含量的检测对于上述多种疾病的诊断和预后具有很大的价值。杜风兰等研究脐血SP．A水平与羊水SP．A水平的相关性，证明脐血可以代替羊水SP．A中水平作为胎肺成熟度

8、的标志，利用westernblot方法，得到斑点杂交结果后用凝胶图象分析系统测定NC膜上各点的相对灰度值，根据标准蛋白相对灰度值曲线，求得待测标本SP．A的实际含量，尚无法达到精确测定的标准。YoshioKuroki等利