拟南芥Rad23原核重组蛋白构建和活性检测.pdf

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1、第38卷第ll期湖南大学学报(自然科学版)V01．38。No．112011年11月JournalofHunanUniversity(NaturalSciences)NOV．2011文章编号：1674—2974(2011)lI-0066—04拟南芥Rad23原核重组蛋白构建和活性检测李秀山，刘斌，赵李剑，唐东英，赵小英，刘选明(湖南大学生物学院，湖南长沙410082)摘要：在拟南芥中，Rad23基因通过参与泛素／26S蛋白酶体途径调节植物生长发育和激素应答．为进一步研究该基因编码蛋白的分子作用机制及其生物学功能，构

2、建了pCold．Rad23融合蛋白重组表达载体，将该载体转化到大肠杆菌BL21中诱导表达目的蛋白．SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果表明，分子质量为94ku左右的融合重组蛋白在大肠杆茵中获得高效表达．采用纯化的重组蛋白多次免疫昆明小白鼠的方法，获得了特异性强并且效价高的多克隆抗体，经蛋白印迹检测，在分子质量4Oku左右处出现特异的蛋白质条带，证明所制备的抗血清可以与拟南芥Rad23蛋白特异性结合．关键词：蛋白；泛素／268蛋白酶体；原核表达；抗体中图分类号：Q511文献标识码：APurificationofArab

3、idopsisRad23RecombinantProteininEngineeringBacteriaandPreparationofItsPolyclonalAntibodyLIXiu—shan，LIUBin，ZHAOLi-jian，TANGDong-ying，ZHAOXiao—ying，LIUXuan—mingt(CollegeofBiologicalSciences，HunanUniv，Changsha-Hunan410082。China)Abstract：Rad23genewhichparticipate

4、sinubiquitin／26SproteasomepathwayinArabidopsis，iSknowntoplayimportantrolesinplantdevelopmentandresponsestohormone．Inordertostudyitsrune—tionandtoolecularmechanism，anexpressionvectorpCold—Rad23wasconstructedandtransformedintoE．∞liBL21．Thentherecombinantfusionp

5、roteinwasinducedbyIPTG．TheresultsofSDS-PAGEhaveshownthatRad23fusionproteinexistedinasolubleformwitharelativemolecularmass94ku，whichisfitforthemolecularmasssupposedfromgenecodingframe．Finally，theRad23recombinantfusionproteinwasusedasanantigentopreparepolyclona

6、lantiseruminmice．Thewesternblotresultshaveshownthatthepolyclonalantiserumhashighspecificityandcanreacttothenativeproteinexpressedindifferenttis—suesofArabidopsis．Keywords：protein；ubiquitin(Ub)／26Sproteasome；prokaryoticexpression；antibodies收稿日期：2011-o1-2O基金项目：

7、国家自然科学基金资助项目(30770200)作者简介：李秀山(1979一)，男，湖南长沙人，湖南大学博士研究生t通讯联系人，E-mail；swxmL@hnu．cn第l1期李秀山等：拟南芥Rad23原核重组蛋白构建和活性检测67蛋白泛素化是真核细胞内广泛存在的一种蛋白定，以AT5G38470基因为模板，上游引物5，-翻译后修饰方式，其在基因表达调控、细胞周期调CCGCTCGAGATGAAGATTTTCGTGAAGACT控、DNA损伤修复及细胞凋亡等多种生物途径中发CTCA一3(引入Xhoj酶切位点)，下游引物为5，

8、-挥重要作用D-2]．研究表明，作为一种复杂且高度调C)GG(飞ccGc一3控的过程，蛋白质泛素化需要3类酶参与催化，这3(引入EcoR工酶切位点)．PCR扩增条件为：94℃类酶分别称为E1一泛素激活酶，E2一泛素耦联酶，预变性5min；94℃变性30S，60℃退火30S，72℃E3一泛素连接酶．泛素化的整个过程大致如下：在延伸60S，30个循环；72℃后延伸10min．