重组人生长激素的原核分泌表达及其活性分析

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1、重组人生长激素的原核分泌表达及其活性分析刘玉林许国杰刘涵刘云南朱秋媚曲丹华雷宇矗王江林刘琳琳张红吕效宇刘景会长春生物制品研宄所有限责任公司细胞因子室长春百益制药有限责任公司质量管理部吉林大学第二医院呼吸与危重症医学科目的构逮重组人生长激素(recombinanthumangrowthhormone,rhGH)分泌表达质粒，进行原核表达，并分析其活性。方法人工合成包含phoA启动子、STII信号肽序列及hGH基因优化序列的目的基因，与pBR322载体连接，构建重组克隆质粒pBR322-hGH;再将0的基因亚克隆至pACYC184载体，构建重组表达质粒pAC-hG

2、ll，进行酶切鉴定及测序分析。将鉴定正确的重组表达质粒pAC-hGll转化至感受态大肠埃希菌W3110中，构建重组工程菌，经诱导表达后进行DEAE-Sepharose吓纯化，纯化产物经SDS-PAGE、分子排阻色谱、N-末端氨基酸序列及活性分析。结果重组表达质粒经酶切及测序鉴定，构建正确。表达产物经SDS-PAGE分析可见相对分子质量约22000的0的条带，菌体相对表达量达30%以上;纯化产物电泳纯度达95%以上，分子排阻色谱保留时间及N-末端15个氨基酸均与国家标准品一致，比活性大于3.0IU/mgo结论成功构建了分泌表达rhGH的重组质粒，且获得了纯度及活

3、性均较高的rhGH,为其产品的开发奠定了基础。关键词：重组人生长激素;原核细胞;基因表达;活性;周质空间是由大肠埃希菌内膜和外膜组成的双层膜结构，能够提供一个适合外源蛋白正确折叠的环境£11。利用大肠埃希菌系统，在外源基因的N-末端融合一段细菌蛋白的疏水信号肽，可将目的蛋白运送至周质空间，经信号肽酶将信号肽切除后，即可获得与天然蛋白一致的构象（不含N-末端多余的甲硫氨酸）位1。本实验利用碱性磷酸酶启动子（phoA）,引入肠毒素信号肽，构建分泌表达rhGH的工程菌，经初步纯化后，进行活性分析。1材料与方法感受态大肠埃希菌W3110及载体pACYC184购自北京六

4、合通经贸有限公司；感受态大肠埃希菌JM109购自美国Promega公司；载体pBR322购自宝生物工程（大连）有限公司。1.2主要试剂质粒小量提取试剂盒、DNA凝胶冋收试剂盒、DNAmarkerDL2000,DNAmarkerXHindIIIdigest>DNA连接试剂盒、低分子量蛋白marker、限制性内切酶Hindlll、EcoRI、SmaI、EcoRV、AvaI、XmmI、SacII、SpeI和PstI均购自宝生物工程（大连）有限公司；其他试剂均为国产分析纯。1.3目的基因的合成根据GenBank中登录的hGH基因（M_000515.2）序列，并按大肠

5、埃希菌密码子使用频率利用密码子使用数据库（CodonUsageDatabase）进行密码子偏爱性优化，优化后的基因序列中加入STII信号肽序列（M35729.1）及phoA启动子序列（CA194177）。由宝生物工程（大连）有限公司人工合成phoAP-STII-hGH基因序列（ti括phoA启动子，STII信号肽序列，hGH优化序列及EcoRI和Smal酶切位点和保护碱基），并进行测序。1.4重组克隆质粒的构建合成的目的基因片段用EcoRI/SmaI双酶切，回收;pBR322载体质粒用Hindlll酶切后，用T4DNAPolymerase补平末端，再用EcoR

6、I酶切，回收载体片段。将回收的目的基因片段（EcoRI/Smal）与载体片段（EcoRI/BluntedHindHI）经T4DNA连接酶于16"C连接过夜;连接产物转化感受态人肠埃希菌JM109,涂布于抗性平板（含15ug/ml四环素），挑取单菌落，提取质粒，经EcoRI和EcoRV双酶切鉴定，鉴定正确的质粒命名为pBR322-hGH。1.5重组表达质粒的构建用EcoRI酶切质粒pBR322-hGH,并用T4DNAPolymerase补平，再经EcoRV酶切，胶冋收1200bp片段。用AvaI酶切pACYC184质粒，并用T4DNAPolymerase补平，再

7、用XmnI酶切，胶回收2280bp片段。将上述两个回收片段用T4DNA连接酶于16°C连接过夜;连接产物转化感受态大肠埃希菌JM109，涂布于抗性平板（含15ug/ml四环素），挑取单菌落，提取质粒，经FxoRI、SpcI单酶切及EcoRI和SpoI双酶切鉴定，将阳性质粒送宝生物工程（大连）有限公司测序，测序正确的质粒命名为pAC-hGH。1.6目的基因的表达取鉴定正确的质粒pAC-hGH转化感受态大肠埃希菌W3110，涂布于抗性平板（含15ug/ml四环素），挑取单克隆接种于5mlLB培养基（含四环素15ug/ml）,37°C,200r/min振荡培养过夜;

8、按1:100的比例转接于500ml含1