sa-hifn-α工作2a双功能融合蛋白原核表达、纯化及体外活性检测

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1、温州医学院硕士学位论文SA-hIFN-Q2a双功能融合蛋白的原核表达、纯化及体外活性检测中文摘要一目的本研究利用本室早期构建的pET24a-SA．L．hIFN-a2a重组表达质粒，在大肠杆菌中表达融合蛋白SA-hIFN．a2a，并对所表达的蛋白采用镍金属螯合(Ni二NTA)层析进行纯化，尿素梯度透析复性，大量制备链亲合素(SA)标记的人源a2a型干扰素融合蛋白(SA-hIFN-a2a)，并对其体外活性进行检测，为进一步的动物实验奠定基础。．方法、1．诱导表达SA．hlFN-a2a融合蛋白用传统的CaCh方法制备Rosetta感受态细胞，首先

2、从大肠杆菌DH5a(由本室保存，含质粒pET24a-SA-L-hIFN—a2a)中提取目的质粒，将质粒转化入感受态细胞中进行活化，经IPTG诱导表达，高压细胞破碎仪破菌，包涵体洗涤。最后应用SDS．P：f6婚E分析检测表达产物。2．融合蛋白SA-hlFN—a2aIPTG诱导条件的优化通过调整IPTG的诱导时间和诱导浓度，应用SDS．PAGE鉴定结果，筛选出最佳的诱导条件。3．WesternBloting鉴定SA．hIFN．a2a融合蛋白的表达通过对未经IPTG诱导表达的菌液和表达后的产物进行免疫印迹分析鉴定，以hIFN-a2a抗体为一抗，以

3、辣根过氧化物酶(HRP)标记．羊抗鼠IgG为二抗，采用DAB显色法进行显色，以鉴定SA．MFN．a2a融合蛋白的表达情况。4．包涵体洗涤、纯化及复性通过细胞压力破碎仪破菌收得包涵体(镍柱亲和层析)，应用本室已成功研制的包涵体洗涤方法进行洗涤，包涵体经过洗涤后用8M尿素溶解进行镍柱亲和层析纯化，通过尿素梯度透析复性后得到融合蛋白，进行SDS．PAGE鉴定结果，并分析复性后蛋白的纯度和浓度。．5．干扰素抗病毒增殖实验和肿瘤细胞锚定实验．将复性的SA．hIFN．a2a融合蛋白采用微量细胞病变抑制法通过A549／VSV系统测定SA．hIFN-a2a

4、的抗病毒增活性；应用流式细胞仪检测SA-hlFN-a2a融合蛋温州医学院硕士学位论文白对膀胱癌细胞MB49细胞的锚定率，初步评价经纯化复性后SA-hlFN．a2a融合蛋白的体外活性。结果1．诱导表达SA．hIFN．-a2a融合蛋白将质粒pET24a-SA．L-hlFN．a2a导入大肠杆菌中后，在带有氯霉素和卡钠霉素抗性的平板中经过370C、16-48h孵育后生长出单克隆菌落，并使菌落过夜活化后370C、220rpm、0．5mmol／LIPTG条件下诱导表达。经SDS．PAGE鉴定目的蛋白出现在约33KD的位置，经BandScan软件分析，S

5、A-hlFN．a2a目的蛋白约占总蛋白的15％。表达菌通过高压破碎后，SDS-PAGE显示目的蛋白主要以包涵体的形式存在于沉淀中。2．融合蛋白SA-hIFN-a2aIPTG诱导条件的优化经过SDS．PAGE鉴定，IPTG诱导时间在4h诱导终浓度为0．5mmoFL时为最佳诱导条件。‘3．WesternBloting鉴定SA-hlFN-a2a融合蛋白的表达未经IPTG诱导表达的菌液和表达后的产物进一步经免疫印迹分析鉴定，其中未经口TG诱导表达的菌液可见到少量目的蛋白表达，为本底表达：经IPTG诱导表达的菌液，可见到大量的目的蛋白(SA．hlFN

6、-a2a融合蛋白)表达。4．包涵体洗涤、纯化及复性将菌体重悬于PBS缓冲液，高压破碎1次(1000MPa)，可达到很好的破菌效果。经洗涤液洗后的包涵体用8M尿素溶解后经过镍柱亲和层析进行分离纯化，目的蛋白被100mmol／L浓度眯唑洗出。经尿素梯度透析复性，复性后的目的条带经SDS—PAGE鉴定融合蛋白的非还原状态主要以多聚体的形式存在，经BandScan软件分析纯度为97％，采用Bradford法测定蛋白浓度为288．96I，tg／ml。5．干扰素抗病毒增殖实验和肿瘤细胞锚定实验通过A549NSV系统鉴定了重组SA-hIFN．a2a融合蛋

7、白对接毒的A549细胞有很好的保护作用，对VSV有明显的抑制效果。我们采用微量细胞病变抑制法，通过A549／VSV系统对重组的SA-hlFN．a2a融合蛋白进行了体外活性测定，其效价约为6．14x107IU／mg；流式细胞仪检测SA-hIFN．a2a融合蛋白对经生物素化的MB49肿瘤细胞锚定率达到98％。。⋯．⋯结论。．本文成功的将pET24a-SA．L-hIFN．a2a质粒导入大肠杆菌中并通过诱导表达方法获得大量工程菌和包涵体，通过镍柱亲和层析纯化，尿素梯度复性后经超滤4温州医学院硕士学位论文浓缩获得高浓度和高纯度的融合蛋白，并在体外采用

8、抗病毒增殖实验和肿瘤细胞锚定实验中初步证实了SA-hIFN．02a双功能融合蛋白的生物学活性，为后续的动物实验奠定了基础。关键词：人a2a型干扰素；链亲和素；融合蛋白；锚定温州医