rgdmelittin融合基因的表达纯化及活性测定

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1、独创性声明本人声明，所呈交的学位(毕业)论文，是本人在指导教师的指导下独立完成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。学位(毕业)论文作者亲笔签名：落咿日期：少形’多·珍论文使用授权的说明本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位(毕业)论文的规定，即学校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布

2、论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。保密，在年后解密可适用本授权书。口不保密，本论文属于不保密。町／学位(毕业)论文作者亲笔签名：艰日期：≯谚．石：哆指导教师亲笔签名：日期：溯‘‘、哆福建农林大学硕士论文RGD-Melittin融合基因的表达纯化及活性测定中文摘要免疫毒素是一类特异杀伤肿瘤细胞的药物，能以抗体或细胞因子为导向载体(该抗体或细胞因子能与肿瘤细胞表面特异表达的抗原或受体结合)同毒素相连，对肿瘤细胞进行特异杀伤的嵌合蛋自。正电性抗菌肽由于其独特的细胞毒机制日益引起人们的关注，而蜂

3、毒溶血肽作为其中典型的一种，具有多种生理活性。本文以大肠杆菌为宿主重组表达Melittin；以Nlelittin为毒性部分，RGD(精一甘一天冬氨酸三肽)为靶向部分，构建膜毒性免疫毒素RGD—Mel；并用pET-30a为表达载体，对嵌合蛋白进行了重组融合表达，初步检测了该嵌合蛋自的体外活性。本研究得到的主要结果如下：从处于活跃表达蜂毒溶血肽时期的中华蜜蜂工蜂毒腺中提取了总RNA，用TaqDNA聚合酶通过RT-PCR获得了中蜂Melittin成熟区的cDNA。在实验过程中发现，与在37—42℃用AMV进行反转录相比，在

4、较高温度下用TaqDNA聚合酶进行反转录有利于获得正确、完整的cDNA。用pUCl8载体构建的pUCT克隆载体克隆了中蜂Melittin成熟区的cDNA，测序结果显示中蜂Melittin成熟区序列与意蜂的相比，中蜂在第33位发生了一个碱基的差异，但这一变异对氨基酸序列无影响，即中蜂与意蜂Melittin的氨基酸序列完全一致。本文采用基因工程的方法，将RGD与中蜂Melittin连接，以大肠杆菌为重组表达宿主，pgT30a为表达载体，对该嵌合蛋白进行了高效表达，并分离纯化了该融合蛋白。经体外细胞实验初步证明该融合蛋白有

5、明显的肿瘤杀伤作用：当天然蜂毒素的浓度达到5．0I．tg／mL时，其肿瘤抑制率为39．6％，RGD—Mel在浓度为5．0斗g／mL时，其肿瘤抑制率已达到45．5％，且RGD—Mel浓度为3．0pg／mL时的肿瘤抑制率已相当于天然蜂毒素在浓度为5．0p卧IlL时的抑制率。重组蛋白RGD-Me]是一种膜毒性抗肿瘤免疫毒素，在体外表现了明显的肿瘤杀伤活性，但尚需进行体内试验以进一步验证其抗肿瘤活性。本研究在肿瘤的导向治疗和临床方面将有很大的潜在应用价值。关键词：RGD肽蜂毒溶血肽融合基因活性测定抗肿瘤福建农林大学硕士论文R

6、GD-Melittin融合基因的表达纯化及活性测定Prokaryticexpression，purificationandbioactivityofRGD—MelfusiongeneAbstractTheimmunotoxinisaspecialanti—tumormedicine，itCanexactlycombinetothespecial-expressedantigenoracceptoronthetumorcellsurfaceguidedbytheanti—bodyorcell—factor，andthe

7、ndestroythetumorcell．Melittin，asatypicalcationicantimicrobialpeptides(CAP)，isphysiologicallyactive．ThisprojectaimedatexpressingmelittininE．coli，byconstructingamembrane-toxicimmunotoxin，RGD—Mel，inwhichmelittinWastoxicpartandRGD(Arg—Gly—Asp)Wastargetpart．Thefusio

8、nproteinwasexpressedusingpET30avector，anditsactivityWastestedinvitro．Themainresultswereasfollowings：ThetotalRNAwasextractedfromvenomglandofApisceranaceranaworkeratmelittinhi