重组小鼠ck2α′亚基的gst融合表达、纯化及活性测定论文

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1、重组小鼠CK2α′亚基的GST融合表达、纯化及活性测定论文黄雪坤，梁景耀，刘新光，梁念慈【摘要】目的：研究重组小鼠CK2α′亚基在大肠杆菌中的谷胱甘肽S转移酶(GST)融合表达和纯化后活性的测定.方法：将含有小鼠CK2α′cDNA的pGEXGSTMCK2α′重组质粒转化大肠杆菌BL21，异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，采用谷胱甘肽琼脂糖珠4B柱纯化，SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳银染鉴定.将纯化的CK2α′与CK2β以不同的摩尔比混合，找到构成有完全活性的CK2全酶的最佳摩尔比.用各种已知CK2底物鉴定重组小鼠CK2全酶的性质.对纯化的CK

2、2α′和重组CK2全酶进行动力学分析.结果：重组质粒转化表达菌经诱导后出现Mr约为38ku过度表达蛋白.freel）值均小于单独CK2α′，而最大反应速度(Vmax)值均大于单独CK2α′.结论：重组蛋白是小鼠蛋白激酶CK2α′亚基.【关键词】蛋白激酶类；小鼠;原核表达0引言蛋白激酶CK2是一种真核细胞中信使非依赖性丝/苏氨酸蛋白激酶.它是由两个催化亚基(α或α′)和两个调节亚基(β)组成的不均一四聚体［1-2］，其在细胞生存、生长、增殖及凋亡过程中有很重要的功能.由于该酶在细胞中的含量较少，提取纯化得到研究所需的量较为困难，因此，克隆并表达重组蛋

3、白激酶CK2，对于深入研究该酶具有十分重要的意义.我们将含小鼠CK2α′的pGEXGSTMCK2α′质粒进行诱导表达、纯化及测定其活性，以探讨重组蛋白激酶CK2α′是否具有生物活性.1材料和方法1.1材料大肠杆菌BL21(DE3)由卫生部武汉生物制品研究所引进；原核表达载体pGEXGSTMCK2α′由意大利Semplic博士、教授惠赠；胰蛋白胨和酵母提取物(英国Oxoid公司)；异丙基硫代半乳糖苷(IsopropylβD1Thiogalactopyranoside，IPTG)(美国Sigma公司)；谷胱甘肽琼脂糖珠4B柱纯化试剂盒（瑞典

4、AmershamPharmacia公司）；丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺（美国BioRad公司）；［γ32P］ATP和［γ32P］GTP(北京亚辉生物医学工程公司).1.2方法1.2.1蛋白激酶CK2α′细胞转化、原核表达和纯化将pGEXGSTMCK2α′转化感受态表达菌BL21,铺入含氨苄青霉素的LB琼脂平板上倒置培养,挑取单菌落加10mL含Amp的LB培养基过夜振荡培养,次日按500mLLB培养基加2.5mL过夜培养菌,一次培养2000mL,于37℃剧烈振荡培养,当A595nm到达0.5时,加IPTG至终浓度为1mmol/L进行诱导表达.继续

5、培养4h后收获细菌,4000g,4℃离心10min，沉淀用含0.2mmol/L苯甲基磺酰氟的生理盐水洗涤2次,称湿重，超声破碎,30000g4℃,离心15min.上清按谷胱甘肽琼脂糖珠4B操作说明书进行谷胱甘肽S转移酶(glutathionestransferase，GST)融合蛋白的柱纯化,.freelmol/LTrisHCl,pH7.2,150mmol/LKCl,10mmol/LMgCl2,50μmol/LATP,［γ32P］ATP或GTP1.85×104Bq(比活1.85×1017Bq/mol),去磷酸化酪蛋白2g/L.反应温度为30

6、℃.加15μL层析收集的酶液启动酶反应,反应10min后取30μL点至直径2cm的P81磷酸纤维素滤纸上终止反应,阴干,用85mmol/L磷酸洗涤数次,最后用丙酮洗涤1次,80℃烤干后,加闪烁液于液闪仪计数.每收集管做2个平行管测活(但酶性质实验则做3个平行管).每分钟催化1pmol［γ32P］ATP或GTP上的32P转移到酪蛋白上所需的酶量为1个酶单位.1.2.3蛋白定量和SDSPAGE蛋白质密度扫描蛋白定量按文献［4］的方法,以牛血清白蛋白作为标准进行定量.表达的CK2α′亚基蛋白占菌体总蛋白的比例则用扫描仪扫描SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳图

7、上相应的泳道，再使用QuantiScanDemo软件对这泳道上的各种蛋白带进行半定量扫描，得出各种蛋白带的吸光度值（波浪线下的面积代表对应蛋白的质量），将目的蛋白的吸光度值除以各种蛋白带的总吸光度值，从而算出目的蛋白占菌体总蛋白的比例.2结果2.1小鼠蛋白激酶CK2α′亚基在大肠杆菌中的表达重组质粒pGEXGSTMCK2α′转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导后可大量表达出一Mr约为64×103的新蛋白分子(图1,泳道2),与GST(Mr约为26×103)和小鼠CK2α′亚基(Mr约为38×103)的理论Mr总值相符.而未用IPTG诱导的表达菌中

8、CK2α的过度表达则不明显(图1,泳道1)，说明重组质粒在大肠杆菌中得到了特异高效表达.图1,泳道2扫描结果表明，表达的融