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《小鼠蛋白激酶ck2 亚基的克隆表达及活性测定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、392基础医学与临床 BasicMedicalSciencesandClinics2003123(4)文章编号:100126325(2003)0420392207小鼠蛋白激酶CK2β亚基的克隆、表达及活性测定1#2#1131陈小文,郑克勤,梁景耀,刘新光,梁念慈(广东医学院11生物化学和分子生物学研究所;21医学遗传研究室,湛江524023)摘要:通过反转录PCR从NIH3T3小鼠成纤维细胞中获得小鼠蛋白激酶CK2β亚基编码区cDNA;构建其表达质粒并经测序证明其编码小鼠蛋白激酶CK2β亚基,但与两种已报道的小鼠CK2β亚基cDNA编
2、码区序列分别存在一个碱基差异,与大鼠、猪、兔和人CK2β亚基cDNA的编码区相应碱基序列则一致。将其在表达菌BL21(DE3)中诱导表达,出现一26kDa分子量蛋白过度表达,表达蛋白占菌体总蛋白的3117%,但大多数以不溶形式存在。Westernblot鉴定表明:过度表达产物能与抗人CK2β亚基抗体发生特异性免疫反应。当CK2α和β亚基以1:1摩尔比混合时,构成性的CK2全酶显示出最大活性,直接表明CK2β亚基对CK2α有激活作用。这些结果有力地证明了克隆表达的重组蛋白是小鼠蛋白激酶CK2β亚基。关键词:β调节亚基P蛋白激酶CK2P小鼠
3、;分子克隆;DNA测序;表达;免疫印迹+中图分类号:Q55517;Q78 文献标识码:A 蛋白激酶CK2是真核细胞中普遍存在的信使111 材料非依赖性丝氨酸P苏氨酸蛋白激酶,由两个催化亚基NIH3T3小鼠成纤维细胞购自上海细胞生物(α和P或α′)和两个调节亚基(β)构成(α2β2、αα′β2和所,大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)由武汉生物制品[1,2]α′2β2),在细胞的诸多方面起重要作用。脊椎动研究所引进,原核表达载体pT727由美国哈佛医学物CK2β亚基均由215个氨基酸残基组成,分子量约院的Tabor教授惠赠。RPMI2
4、1640培养基为Gibco产为26ku。CK2β亚基与绝大多数已知蛋白没有同源品,小牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所。性,但其本身在种属间有高度保守性,目前已克隆的反转录试剂盒,dNTP,内切酶HindⅢ为Promega公司所有哺乳类动物CK2β亚基氨基酸序列则完全一产品,内切酶NdeⅠ为MBI公司产品。PyrobestDNA[1]聚合酶为宝生物(大连)有限公司产品。寡核苷酸引致。CK2β亚基主要作用是提高催化亚基的活性、稳定α或α′亚基不易受热变性或酶降解的破坏、决物由上海Sangon公司合成。RNaseA、异硫氰酸胍、[1]N
5、2十二烷基肌氨酸钠、焦炭酸乙二酸(DEPC)、普通定底物的专一性。克隆表达蛋白激酶CK2的各亚基是深入研究的基础,而小鼠是医学研究最常用琼脂糖、硝酸纤维膜(NC膜)和ATP均购自Sigma公的实验动物之一,为此本文对小鼠CK2β亚基cDNA司。T4DNA连接酶,牛小肠碱性磷酸酶(CIP)为进行了克隆、测序、表达及初步鉴定,现将结果报道Roche公司产品。BigDye终止底物循环测序试剂如下。盒、模板抑制试剂(TSR)和最佳性能聚合物6(POP6)为PE公司ABI产品。小量柱离心式回收试剂盒,异1 材料与方法丙基硫代半乳糖苷(IPTG),
6、亮抑酶肽,胃抑酶肽A,低分子量标准蛋白购自上海华舜生物工程有限收稿日期:2002-08-29 修回日期:2002-10-15基金项目:广东省自然科学基金(011766);广东省科技计划项目(2002C30109);湛江市科委科技计划项目(ZK0006);广东医学院标志性成果扶持项目(XK0002)#陈小文、郑克勤为并列第一作者;陈小文现工作单位:深圳市儿童医院儿科研究所3通讯联系人:E1mail:xgliu@gdmc1edu1cn©1995-2004TsinghuaTongfangOpticalDiscCo.,Ltd.Allright
7、sreserved.2003123(4)基础医学与临床 BasicMedicalSciencesandClinics393公司。丙烯酰胺,甲叉双丙烯酰胺和TEMED为Bio2止底物循环测序试剂混合物1μL,200ng质粒DNA,Rad产品,小鼠抗人CK2β亚基的McAb由丹麦Iss2312pmol引物,总反应体积5μL,在PE9600型PCRinger教授惠赠。ECL试剂及相关二抗购自北京中山仪进行单引物PCR循环,循环参数:96℃,30s;公司,胰蛋白胨和酵母提取物为英国Oxoid公司产50℃,30s;60℃,4min,循环数25。
8、经乙酸钠P乙醇32品,[γ2P]ATP为北京亚辉生物医学工程公司生产,法纯化PCR产物,加模板抑制试剂(TSR)95℃,4minTM其余为国产分析纯产品。变性后,将样品放入PEPRISM310型DNA测序仪
