蛋白激酶r的表达纯化及多克隆抗体和单克隆抗体的制备

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1、分类号密级UDC单位代码10733甘肃农业大学硕士学位论文蛋白激酶R的表达纯化及多克隆抗体和单克隆抗体的制备ExpressionandpurificationofproteinkinaseR(PKR)andpreparationofpolyclonalantibodyandmonoclonalantibody张涛指导教师孙晓林教授（甘肃农业大学动物医学院兰州730070）姜丽副研究员（哈尔滨兽医研究所哈尔滨150001）学科专业预防兽医学研究方向兽医公共卫生学论文答辩日期2015年5月30日学位授予日期2015年6月答辩委员会主席才学鹏研究员评阅人

2、刘磊教授张强研究员2015年5月ClassificationNo:Secrecylevel:ZeroUDC:Schoolcode:10733GansuAgriculturalUniversityADissertationfortheMaster’sDegreeExpressionandpurificationofproteinkinaseR(PKR)andpreparationofpolyclonalantibodyandmonoclonalantibodyPostgraduate:ZhangTaoSupervisor:Professor.SunX

3、iao-linAssociateProfessor.JiangLiSpeciality:PreventiveVeterinaryScienceResearchField:VeterinarySanitaryScienceSubmittedTime:May2015Address:Lanzhou,China,730070摘要蛋白激酶R（PKR）可被病毒感染后诱导产生的干扰素和双链RNA激活，是宿主天然免疫系统的重要抗病毒效应因子。但是，许多病毒可以通过自身编码的蛋白拮抗PKR的抗病毒作用，如流感病毒的NS1蛋白。为了给研究PKR与病毒蛋白的相互作用及其

4、机制提供条件，本研究表达纯化了PKR蛋白，并通过免疫动物制备了PKR蛋白的多克隆抗体和单克隆抗体。试验1.蛋白激酶R的原核表达纯化及多克隆抗体的制备利用RT-PCR方法扩增人的PKR基因，定向克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中。经序列测定分析后，将阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，经终浓度0.5mmol/LIPTG诱导表达GST-PKR融合蛋白，表达产物经SDS-PAGE分析后确定融合蛋白获得稳定表达。随后通过Glutathione-sepharose4B亲和层析纯化系统对融合蛋白进行初步纯化，用离子交换层析及分子筛在AKT

5、AExplorer上进一步纯化，得到高纯度无标签的PKR蛋白。将获得的PKR蛋白与等量的弗氏佐剂乳化后免疫新西兰大白兔收集血清，制备多克隆抗体。通过斑点杂交方法检测其效价达到1:50000以上，并经Westernblot和间接免疫荧光（IFA）试验分析显示，多克隆抗体对PKR蛋白具有高度特异性。试验2.蛋白激酶R单克隆抗体的制备利用前面试验表达纯化的PKR蛋白为免疫原，免疫8周龄左右的SPF雌性BALB/C小鼠，进行4次免疫，第4次免疫后3天无菌条件下取小鼠脾细胞与处于对数生长期的SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行融合。通过间接ELIAE方法鉴定阳性杂交

6、瘤细胞，之后利用有限稀释法对效价高的杂交瘤细胞进行4次亚克隆，最终获得持续分泌抗PKR的单克隆杂交瘤细胞3株，分别命名为2E8、4A7、5A4，检测培养基上清中抗体滴度分别为1:3200、1:3200、1:6400，取抗体滴度最高的5A4杂交瘤细胞腹腔注射10周龄左右SPF的BALB/C小鼠，7天后收集腹水，测定腹水效价为1:512000。3株杂交瘤细胞抗体亚型鉴定均为IgG1型。间接免疫荧光（IFA）试验分析显示，单克隆抗体对PKR蛋白具有高度特异性。经间接ELISA检测，获得的3株杂交瘤细胞体外传代培养多代和冻存复苏后细胞培养基上清中抗体的滴度

7、和OD值基本一致，抗体能持续的分泌，表明PKR单克隆抗体制备成功。关键词：PKR；原核表达；蛋白纯化；多克隆抗体；单克隆抗体ISummaryProteinkinaseRalsoknownasthedouble-strandedRNA-activatedproteinkinase(PKR),isanimportantantiviraleffectorofhostinnateimmunesystemandisactivatedbytheinterferonanddouble-strandedRNAinducedbyviralinfection.Howe

8、ver,manyvirusesareabletoantagonizetheantiviraleffectofPKRthro