tdg蛋白的表达纯化及多克隆抗体的制备

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1、TDG蛋白的表达纯化及多克隆抗体的制备李石营,兰燕，唐波，华子春【摘要】目的：表达纯化胸腺嘧啶糖苷酶(TDG)蛋白并制备TDG多克隆抗体。方法：PCR扩增小鼠TDG(mTDG)的基因片段并插入pET28a(+)原核表达载体，表达并纯化HismTDG融合蛋白。用纯化的HismTDG蛋白免疫兔子产生抗血清，进一步亲和纯化抗血清制备抗TDG的多克隆抗体，并检测分析制备的抗体在ethods:MouseTDG(mTDG)plifiedbyPCRandthenTDGproteinmunizerabbit.Purifiedan

2、tibodyatographycolumn，anditsapplicationsmunofluorescenceanalysis.Results:HismTDGfusionproteinostallsolubleatloperature(20℃)andlomol·L-1).Thefusionproteinmunizerabbits,theantibodyagainstTDGmunoassays.Conclusion:O1和SUMO3相互作用，而且能够被它们共价修饰[10-12]，SUMO化修饰影响了TDG的结构

3、和酶活特征，是TDG发生错配修复过程中所必需的生物学事件[13]，HeLa细胞样品的O条带，大约86kD[13]。另外，研究报道，TDG定位在细胞核内[10,14]。　　为了开展对TDG的研究，我们自己表达并纯化了鼠源的TDG蛋白，并用纯化的蛋白免疫兔子制备了高滴度的多克隆抗血清，进一步亲和纯化抗血清，获得了高质量的antiTDG多克隆抗体，制备的抗体能够在SF)重悬菌体，超声裂解20min(脉冲5s，间隔10s)，13500×g离心15min。将收集的上清以0.5ml·min-1的速率加载到TrisHCl缓冲液

4、预平衡的Ni+亲和柱，上样完毕后用TrisHCl缓冲液充分洗涤至基线，再分别用含有10mmol·L-1和50mmol·L-1咪唑的缓冲液洗涤杂蛋白，最后用含250mmol·L-1咪唑的缓冲液洗脱目的蛋白。通过Ni+亲和柱纯化的洗脱蛋白立即使用SephadexG15凝胶柱层析去除咪唑。纯化后的蛋白加入10%的甘油后，保存在-80℃。　　1.2.3TDG的活性分析TDG的活性分析参照文献[15]进行，T44(5＇aattgggctcctcgaggaattTgccttctgcaggca　　tgccccgg3＇)在5

5、＇端用[γ32P]ATP标记，然后与G44(5＇ccggggcatgcctgcagaaggcGaattcctcgaggagcccaatt3＇)退火形成异源双链，即测活反应的DNA底物。测活反应体系为：50mmol·L-1TrisHCl(pH8.0)，1mmol·L-1DTT，50μg·ml-1BSA，1mmol·L-1EDTA，3%甘油，DNA底物0.3nmol·L-1和适量的TDG蛋白，10μl反应体系37℃反应30min，加入1.1μl1mol·L-1的NaOH，90℃反应30min，迅速置冰上，短暂离

6、心后，加入5μl测活loading(90%formamide,10mmol·L-1EDTA,0.1%xylenecyanol,0.1%bromophenolblue)。取10μl混合物用14%聚丙烯酰胺测序胶分离，Tyhoon9410ersham)进行扫描与分析。　　1.2.4多克隆抗血清的制备与纯化先取2～3ml兔子血液作为免疫前阴性对照，用完全弗氏佐剂乳化500μg纯化的TDG蛋白后，皮下多点注射在兔子的背部和颈部，2周后加强免疫，用不完全弗氏佐剂乳化蛋白。以后每间隔2周加强免疫1次，在加强免疫3次后，用纯化的蛋

7、白做ELISA检测抗体的效价，结果显示1只兔子效价很好，滴度大约为214，另1只的滴度不太好，大约为29。颈部采血处死兔子，收集血清。　　先用IgGbinding缓冲液(10mmol·L-1TrisHCl,pH7.5)平衡ProteinA柱子，效价较高(214)兔子的血清样品上柱后吸附10min，然后用2～3倍体积的binding缓冲液洗去杂蛋白，再用洗脱缓冲液(0.1mol·L-1glycinebuffer,pH2～3)洗脱，洗脱下来的IgG用1.0mol·L-1Tris(pH7.5)中和。产生的多克隆抗体加入0

8、.02%的叠氮钠和20%甘油后，保存于-80℃。　　1.2.5细胞培养和转染小鼠黑色素瘤细胞B16F10和人胚胎肾细胞293T购自AmericanTypeCellCulture(ATCC)，用含有10%小牛血清的DulbeccosmodifiedEaglesmedium(DMEM)培养。对于.蛋白Marker;Lane1～3.依次为未经IP