tdg蛋白的表达纯化及多克隆抗体的制备

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1、TDG蛋白的表达纯化及多克隆抗体的制备作者：李石营,兰燕，唐波，华子春【摘要】目的：表达纯化胸腺嘧啶糖苷酶(TDG)蛋白并制备TDG多克隆抗体。方法：PCR扩增小鼠TDG(mTDG)的基因片段并插入pET28a(+)原核表达载体，表达并纯化HismTDG融合蛋白。用纯化的HismTDG蛋白免疫兔子产生抗血清，进一步亲和纯化抗血清制备抗TDG的多克隆抗体，并检测分析制备的抗体在Westernblotting和免疫荧光分析中的应用。结果：在低温(20℃)和低IPTG浓度(0.2mmol·L-1)时，HismTDG融合蛋白大部分在可溶上清部分，用亲和层析法分离

2、纯化了HismTDG蛋白，并用纯化的蛋白制备了兔抗TDG抗体，结果显示制备的抗体能够特异性地在免疫分析中使用。结论：本研究纯化了条带单一的并且具有生物学活性的TDG融合蛋白，制备了具有良好特异性的兔抗TDG抗体，为进一步研究TDG的性质、结构和功能奠定了基础。【关键词】胸腺嘧啶糖苷酶;原核表达;纯化;多克隆抗体　　[Abstract]Objective:ToexpressandpurifyTDGprotein,andtopreparetherabbitantibodyagainstthymineDNAglycosylase(TDG)protein.Metho

3、ds:MouseTDG(mTDG)wasamplifiedbyPCRandthenwasinsertedintothefusionexpression15vectorpET28a(+).AfterbeingexpressedinE.coliBL21,theHismTDGproteinwaspurifiedandusedtoimmunizerabbit.Purifiedantibodywasobtainedthroughaffinitychromatographycolumn，anditsapplicationswereevaluatedthroughWest

4、ernblottingandimmunofluorescenceanalysis.Results:HismTDGfusionproteinwasalmostallsolubleatlowtemperature(20℃)andlowIPTGcondition(0.2mmol·L-1).Thefusionproteinwaspurifiedandusedtoimmunizerabbits,theantibodyagainstTDGwasobtained.Thefurtherresultsshowedthattheantibodyhadagoodspecifici

5、tyinimmunoassays.Conclusion:WehavepurifiedmTDGfusionproteinwithanobviouslyhomogeneousbandandhighbiologyactivityandpreparedtherabbitantibodyagainstTDGsuccessfully,whichlaysthefoundationforfurtherstudyonitscharacter,structureandfunction.　　[Keywords]thymineDNAglycosylase;prokaryoticexp

6、ression;purification;polyclonalantibody　　DNA甲基化联系着基因沉默，是重要的基因转录调控方式和常见的DNA复制后修饰形式，在生长调控和分化中扮演了重要作用[1]。然而，胞嘧啶甲基化也是基因组不稳定的一个根源[2]，因为DNA脱甲基化是通过脱氨基途径先形成G∶T错配，然后修复G∶15T错配进行[3]。甲基化胞嘧啶自发水解脱氨基形成的错配是基因组内源最常见的突变原因之一[4-5]，而基因组的突变往往导致各种癌症等疾病[6-7]。幸运的是，所有生物都进化出了修复G∶T错配的酶，胸腺嘧啶糖苷酶(TDG)是一个修复G∶T错配的重

7、要蛋白酶[8]。人源TDG蛋白包含410个氨基酸，小鼠的含421个氨基酸，然而，TDG蛋白在SDSPAGE中的条带位置大约在60kD[9]。TDG不仅和SUMO1和SUMO3相互作用，而且能够被它们共价修饰[10-12]，SUMO化修饰影响了TDG的结构和酶活特征，是TDG发生错配修复过程中所必需的生物学事件[13]，HeLa细胞样品的Westernblotting结果显示，TDG有两条带：一条是TDG条带，大约60kD，一条是TDGSUMO条带，大约86kD[13]。另外，研究报道，TDG定位在细胞核内[10,14]。　　为了开展对TDG的研究，我们

8、自己表达并纯化了鼠源的TDG蛋白，并用