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《小鼠蛋白激酶 亚基的克隆、测序、 !# 表达及初步鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、《癌症》$%&’()(*+,-’./+0$.’1(-2344323#5!6：!"#7!"8!"#小鼠蛋白激酶!"#!亚基的克隆、测序、表达及初步鉴定陈小文##!3#2刘新光2郑克勤2梁念慈5广东医学院#9生物化学和分子生物学研究所；39医学遗传研究室，广东湛江"3:43;6【摘要】背景与目的：蛋白激酶$<3是一种高度保守性的真核细胞中普遍存在的丝=苏氨酸激酶，它的活性在人的许多肿瘤细胞是升高的，可作为一种癌基因起作用。为了深入进行$<3结构与功能的研究，本研究拟构建小鼠蛋白激酶$<3!亚基1>?@重组表达质粒，并进行表达和初步鉴定。方法：通过反转录A$B从?CD;E;小
2、鼠成纤维细胞获得小鼠$<3!亚基编码区1>?@。将!"#"=$%&DC双酶切A$B产物连接到同样双酶切并经牛小肠碱性磷酸酶去磷酸化的表达载体FE!G!进行定向克隆。转化感受态大肠杆菌>D"!获得转化子，琼脂糖凝胶电泳初步筛选转化子2将阳性克隆进行单和双酶切分析鉴定。随机挑选:个阳性克隆进行>?@测序，将序列完全正确的重组质粒转化表达菌HI3#5>J;6，挑单克隆小量培养，CAEK诱导表达，L()M(-’N/+M鉴定。结果：转化子的阳性筛选率为#44O；限制性酶切分析结果表明，插入片段和重组质粒的大小与理论推测值相符。>?@正反向测序结果表明P从:个阳性克隆中筛选到#个A
3、$B过程不产生突变的重组质粒，并将其质粒命名为FEQ$<@。重组质粒转化表达菌经CAEK诱导后出现一分子量:3R>.蛋白过度表达，L()M(-’N/+M结果证明过度表达产物能与抗人$<3!亚基抗体发生特异性免疫反应。结论：重组小鼠蛋白激酶$<3!亚基的克隆表达获得成功。关键词：!催化亚基=蛋白激酶$<3=小鼠S分子克隆S>?@测序；表达；免疫印迹中图分类号：T"""U9!，T!V:2T"3;U9V2T!V8文献标识码：@文章编号：#4447:8!W5344364!74!"#748!"#$%$&’()*+)$,%$&’-./0)11%#$，2$340%520673)$8%
4、9%,28%#$#9:),#5;%$2$8<#+1)40#8)%$=%$21)!=>!(+;+$%8##!3#$DJ?W&.+GX(’2ICYW&’GZ,.’Z2[DJ?K<(G&’2IC@?K?&.’G1&’()*+,-,.,#/0$-/12#&-+,34%*"5/6#1.6%3$-/6/7489(:#+#%312;%/66#7#8?2%*@-%*78A9BC9D8E(:(>2-*%【?;1802,8】@2,A&0#+$3BC;D),8%E)：A-+M(&’R&’.)($<3&).%&Z%/]1
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