幽门螺杆菌毒素相关基因的克隆、测序及表达

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1、幽门螺杆菌毒素相关基因的克隆、测序及表达摘要:目的分段扩增、克隆幽门螺杆菌毒素相关基因cagA中间区cag1，cag2，并利用大肠杆菌系统表达.方法PCR法扩增cagA基因，双脱氧中止法测序正确后，克隆入大肠杆菌表达载体pBV220，受控于PRPL启动子，转化大肠杆菌DH5α，42℃进行温度诱导.结果PCR分段扩增出cagA中间区基因cag1，cag2，分别为975，755bp，克隆入pUC19质粒，测序正确;在pBV中构建cag1，cag2的重组表达载体pBVcagA1，pBVcagA2，工程菌诱导后SDS-PAGE显示

2、新生表达蛋白带，Mr:Cag136×103，Cag227.9×103，均与预期的cagA蛋白Mr一致，约占菌体总蛋白的36%和24%.结论成功克隆分段扩增的cagA中间区基因，并可在大肠杆菌DH5α中高效表达.　　Keyper-atureinduce　　Abstract:AIMToamplifyandclonethemiddleregionofHelicobacterpyloricagAgene，andexpresstheproteinsinE.coli.METHODSAfterthecag1andcag2plifiedb

3、yPCRandsequencdbydideoxymethods，theyoters.TherebinantplasmidspBVcag1andpBVcag2edintoE.coliDH5αandinducedat42℃respectivelytoexpresstheencodedpro┐teins.RESULTSThemiddleregionofcagAplifiedand975，755bpproductsountedto36%and24%oftotalbacterialproteinrespectively.CONCLU

4、SIONTheH.pyloricagAmiddleregionmightbesuccessfullyclonedandefficientlyexpressedfractionallyinE.coli.　　0引言　　毒素相关基因A（cytotoxin-associatedgene，cagA）基因是cag致病岛的一部分，其OFR约3542bp左右，3’端存在变异，相应蛋白Mr为（1.28～1.40）×105［1］，是胃内致病微生物幽门螺杆菌（Hp）主要的毒力因子之一，参与胃、十二指肠溃疡及胃癌等的发病，并与疾病的转归有关［2-

5、4］.中国Hp感染率高达80%以上，且大多为cagA+Hp的感染［5］.现在一些Hp标准菌株的cagA基因已克隆［6，7］，其表达产物cagA具有较强的抗原性，其滴度可反应Hp株间的毒力差异，而且和疾病发展也有一定的相关性［1］.对Hp感染的检测可通过对抗cagA抗体的检测进行.将cagA分段表达，同时用来检测患者血清，可以更全面、准确、清晰地了解患者Hp的感染情况.我们利用原核表达系统分段克隆表达cagA基因中间区，为Hp感染的检测及治疗提供基础.　　1材料和方法　　1.1材料大肠杆菌JM109，DH5α，pUC19及p

6、BV220质粒为本所保存;pMC3为含cagA基因5’端大部分的pBluescript质粒，由美国Vanderlilt大学Tummuru博士惠赠.限制性内切酶、连接酶、核酸修饰酶及Taq酶均为宝生物公司产品.　　1.2方法据标准菌株cagA序列［6，7］设计PCR引物，进行分段扩增:　　cag1正向ACAGAATTCATGGACATGGATCCCAATTACAAGT反向GTTGTCGACTTACTCGTCATAGTTGCCTGTGTT　　cag2正向AGAGGATCCATGGAGGTGAAACGAGCTCAG反向TCACT

7、GCAGTGGCCTCTATTCCAGATAACC　　cag1正向引物加起始码（ATG）及EcoRI酶切位点，反向引物上加终止码（TAA）及SalI酶切位点;cag2正向引物加起始码（ATG）及BamHI酶切位点，反向引物上加终止码（TAA）及PstI酶切位点.以pMC3为模板，反应条件为95℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃1min.PCR产物克隆及鉴定用EcoRI+SalI（cag1），BamHI+PstI（cag2）分别双酶切纯化的PCR产物与pUC19质粒，连接外源DNA与对应线性化pUC19质粒，

8、转化E.coliJM109，氨苄青霉素抗性及蓝白筛选，挑选白色克隆，酶切鉴定重组克隆.核苷酸序列由基康公司测序.H.pyloricag1，cag2与表达载体的重组.　　目的蛋白的诱导表达:工程菌在含氨苄青霉素（100mgL-1）的LB培养液中30℃振荡过夜，次日按1%转接扩大培养，继续30℃振荡2～4h