幽门螺杆菌毒素相关基因的克隆、测序及表达论文

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1、幽门螺杆菌毒素相关基因的克隆、测序及表达论文.freelper-atureinduceAbstract:AIMToamplifyandclonethemiddleregionofHelicobacterpyloricagAgene，andexpresstheproteinsinE.coli.METHODSAfterthecag1andcag2plifiedbyPCRandsequencdbydideoxymethods，theyoters.TherebinantplasmidspBVcag1andpBVcag2edintoE.coliDH5αandinducedat42

2、℃respectivelytoexpresstheencodedpro┐teins.RESULTSThemiddleregionofcagAplifiedand975，755bpproductsountedto36%and24%oftotalbacterialproteinrespectively.CONCLUSIONTheH.pyloricagAmiddleregionmightbesuccessfullyclonedandefficientlyexpressedfractionallyinE.coli.0引言毒素相关基因A（cytotoxin-associatedg

3、ene，cagA）基因是cag致病岛的一部分，其OFR约3542bp左右，3’端存在变异，相应蛋白Mr为（1.28～1.40）×105［1］，是胃内致病微生物幽门螺杆菌（Hp）主要的毒力因子之一，参与胃、十二指肠溃疡及胃癌等的发病，并与疾病的转归有关［2-4］.中国Hp感染率高达80%以上，且大多为cagA+Hp的感染［5］.现在一些Hp标准菌株的cagA基因已克隆［6，7］，其表达产物cagA具有较强的抗原性，其滴度可反应Hp株间的毒力差异，而且和疾病发展也有一定的相关性［1］.对Hp感染的检测可通过对抗cagA抗体的检测进行.将cagA分段表达，同时用来检测患者血清

4、，可以更全面、准确、清晰地了解患者Hp的感染情况.我们利用原核表达系统分段克隆表达cagA基因中间区，为Hp感染的检测及治疗提供基础.1材料和方法1.1材料大肠杆菌JM109，DH5α，pUC19及pBV220质粒为本所保存;pMC3为含cagA基因5’端大部分的pBluescript质粒，由美国Vanderlilt大学Tummuru博士惠赠.限制性内切酶、连接酶、核酸修饰酶及Taq酶均为宝生物公司产品.1.2方法据标准菌株cagA序列［6，7］设计PCR引物，进行分段扩增:cag1正向ACAGAATTCATGGACATGGATCCCAATTACAAGT反向GTTGTC

5、GACTTACTCGTCATAGTTGCCTGTGTTcag2正向AGAGGATCCATGGAGGTGAAACGAGCTCAG反向TCACTGCAGTGGCCTCTATTCCAGATAACCcag1正向引物加起始码（ATG）及EcoRI酶切位点，反向引物上加终止码（TAA）及SalI酶切位点;cag2正向引物加起始码（ATG）及BamHI酶切位点，反向引物上加终止码（TAA）及PstI酶切位点.以pMC3为模板，反应条件为95℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃1min.PCR产物克隆及鉴定用EcoRI+SalI（cag1），BamHI+PstI（cag2

6、）分别双酶切纯化的PCR产物与pUC19质粒，连接外源DNA与对应线性化pUC19质粒，转化E.coliJM109，氨苄青霉素抗性及蓝白筛选，挑选白色克隆，酶切鉴定重组克隆.核苷酸序列由基康公司测序.H.pyloricag1，cag2与表达载体的重组.目的蛋白的诱导表达:工程菌在含氨苄青霉素（100mgL-1）的LB培养液中30℃振荡过夜，次日按1%转接扩大培养，继续30℃振荡2～4h，当A600nm=0.6时，立即转入42℃水浴摇床快速振荡5h.SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）:4℃离心收集菌体，用含3mLL-1巯基乙醇载样液处理（100℃6～8min），

7、考马斯亮蓝R-250染色.2结果PCR扩增cag1，cag2，分别得到975和755bp的片段（Fig1）.随机挑选白色克隆，经双酶切鉴定，证实含有975和755bp的插入片段（Fig2）.阳性克隆送交基康公司测序，测序正确.2.1pBV┐cag1，pBV┐cag2表达质粒的构建用EcoRI+SalI（c1），BamHI+PstI（c2）分别酶切pUC19-c1，pUC-c2重组克隆和pBV220，经回收分别得到cag1，cag2基因和线性化pBV220，连接外源DNA和线性化pBV220，转化DH5α感受态细胞，氨苄青霉素抗性筛选，挑选