幽门螺杆菌NCTC11639基因hpaA的克隆表达及鉴定.doc

《幽门螺杆菌NCTC11639基因hpaA的克隆表达及鉴定.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、幽门螺杆菌NCTC11639基因hpaA的克隆表达及鉴定作者：谷祯梅籍会彩向春艳温淑娟【摘要】目的获取幽门螺杆菌（Hp）hpaA基因的序列，预测其编码蛋白hpaA作为候选疫苗的可行性，在大肠杆菌表达系统中表达hpaA。方法提取Hp标准株NCTC11639的基因组DNA，使用PCR扩增hpaA基因，克隆入pGEMT载体中测序，并进行同源性分析。将hpaA克隆入表达载体pGEX4T1中，诱导表达，SDSPAGE电泳鉴定。结果同源性分析表明hpaA具有很高的保守性，成功构建出可以高效、分泌型表达hpaA的原核表达系统。结论hpaA具有高保守性，在Hp各菌株中普遍存在，是有良好

2、应用前景的Hp候选疫苗。【关键词】hpaA基因；克隆表达；SDSPAGE【Abstract】ObjectiveTheintentionofthisstudycanbesubscribedinthreeaspects:obtainingthesequenceofHelicobacterpylorigenehpaA,predictingwhetherproteinhpaAhaspotentialtobecomeavaccinecandidateofHpandexpressinghpaAinE.coliheterogeneousexpressionsystem.MethodsThe

3、hpaAgenewasamplifiedfromthegenomeofHpstrainNCTC11639andthenclonedintovectorpGEMT.Thesequencehasbeenobtainedbysequencingtherecombinantvector.ThepGEX4T1wasusedtoconstructexpressionsysteminE.ColistrainBL21andtheexpressionresultverifiedbySDSPAGE.ResultsThehomogeneousanalysisshowedthathpaAisa

4、highlyconservativegene.AnefficientandsecretiveexpressionsysteminBL21wasconstructed.ConclusionTheresearchindicatesthathpaAisauniversalandhighlyconservativegeneandhpaAisapromisingvaccinecandidateofHelicobacterpylori.【Keywords】GenehpaA；Cloneandexpression；SDSPAGE幽门螺杆菌(helicobacterpylori，Hp)是慢性胃

5、炎和消化性溃疡的重要致病菌，并与胃腺癌和胃粘膜相关B细胞淋巴瘤的发生密切相关。如何有效控制Hp感染，一直为国内外学者所关注。目前临床上多采用抗生素治疗Hp感染，但Hp容易产生耐药性，导致抗生素治疗失效，并且Hp未能根除，大多数患者很快又旧病复发，因此开发疫苗被认为是控制Hp感染最有效的方法。但迄今为止，尚未开发出成功Hp的疫苗，筛选合适的抗原表位仍是目前Hp疫苗研究的热点。Hp的主要粘附素为N乙酰神经氨酰乳糖结合原纤维样血凝素(Nacetylneuraminyllactosebinding4haemagglutinin，NLBH)，hpaA是其亚单位，并且作为核心组成部

6、分，主要参与编码鞭毛鞘壳和外膜中的脂蛋白［1-3］。hpaA在Hp感染过程中不可或缺，hpaA突变的Hp菌株无法在小鼠体内定植［4］，目前hpaA的具体功能尚未阐明。本项研究旨在探讨hpaA蛋白作为抗Hp感染的候选疫苗的可行性，拟构建可高效表达hpaA的原核表达系统，并获得重组hpaA蛋白。1材料和方法1.1菌株与培养基Hp标准株NCTC11639、大肠杆菌Top10及BL21来源于本实验室菌种库。重组大肠杆菌所用培养基为LB培养基。1.2实验试剂细菌基因组提取试剂盒、质粒小量提取试剂盒、DNAMarker均购自天为时代，一管式PCR反应体系及PCR产物纯化试剂盒购自英韦创津公

7、司，限制性内切酶BamHI和HindIII以及低分子量蛋白质Marker购自TaKaRa公司。1.3扩增及克隆设计用于扩增hpaA的引物，并送交TaKaRa公司合成。hpaA1：5'GGATCCATGAAAGCAAATAATCATTTTAAAG3'hpaA2：5'AAGCTTTTATGGGTTTCTTTTGCCTTTTAA3'利用以上引物和一管式PCR反应体系，从提取到的HpNCTC11639基因组中扩增hpaA。扩增条件：盖温105℃，预热94℃10min，(94℃30s，50℃1