人bit1 cdna基因的克隆、测序及表达论文

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1、人bit1cDNA基因的克隆、测序及表达论文邢小红，吴元明，王哲，王文勇，黄高【关键词】克隆分子【Abstract】AIM：Toclonethehumanbit1cDNAgeneandexpressitinE.coli.METHODS:TotalRNAfreshplacentatissueandreversetranscriptedtosinglechaincDNA.Byusingitasthetemplate,thehumanbit1cDNAgeneplified.ThecDNAgeneanbit1cDNAgeneplifiedbyusingthedesignedprimerandtheg

2、eneountofprotein.CONCLUSION:Thehumanbit1cDNAgeneisamplifiedandexpressedinE.coli,portantforthestudyonthefunctionofhumanbit1protein.【Keyentary;cloning,molecular;sequenceanalysis;geneexpression【摘要】目的：克隆并在大肠杆菌中表达人bit1cDNA基因.方法：从新鲜的胎盘组织中提取总RNA，经反转录成单链cDNA,以此为模板扩增出人bit1cDNA基因，将该基因克隆入载体pUC19中，测序正确后亚克隆入表达载

3、体pGEX4T3中进行表达.结果：利用所设计的引物扩增出完整的人bit1cDNA基因.以大肠杆菌为宿主在IPTG的诱导下获得表达.freelRNA长约1kb，编码179aa的蛋白质，Bit1蛋白Mr约27000.Bit1蛋白的N端为一线粒体定位序列，C端为一未知功能结构域UPF0099.Northern杂交显示bit1基因在前列腺、骨骼肌、肝脏高表达，而在心脏、脾、结肠低表达.人胸腺及外周血白细胞中几乎检测不到它的表达.Bit1存在于线粒体中，如果释放到胞质中，就和AES（aminoterminalenhancerofsplit）［2］结合并促进细胞凋亡.纤粘连素和细胞的结合可以抑制这种凋亡

4、.虽然Bit1蛋白可以促进细胞凋亡，但其具体的信号转导通路还不清楚.我们拟从人胎盘组织中克隆人bit1cDNA基因，并在大肠杆菌中进行表达，为进一步研究bit1基因的功能及其与肿瘤发生的关系奠定基础.1材料和方法11材料TRIzol(r)Reagent为GibcoBRL公司产品；SupersciptⅡ反转录试剂盒购自invitrogen公司；PfuDNA聚合酶为鼎国公司产品；限制性内切酶，IPTG，dNTP,DL2000DNAMarker购自Takara公司；凝胶DNA纯化试剂盒为赛百盛公司产品；RNaseA及其他分子生物学常用试剂均为华美公司产品.Top10菌种由第四军医大学病理学实验室保

5、存.12方法121单链cDNA模板的制备用TRIzol(r)Reagent从新鲜的胎盘组织中提取总RNA，提取的RNA用紫外分光光度计进行定量.按照SupersciptⅡ反转录试剂盒的说明将提取的总RNA反转录为单链cDNA.122引物设计上游引物：5′GGAATTCGCCCTCCAAATCCTTGGTTATG3′，含EcoRI识别位点；下游引物：5′CGGGATCCGATGGAGGGGTTGTTGTCATA3′，含BamHI识别位点；123人bit1cDNA基因的扩增以单链cDNA为模板进行人bit1cDNA基因的扩增.在50μL反应体系中，加入10×PCR缓冲液5μL，TaqDNA聚合酶

6、1μL（4168mkat/L）,dNTP1μL（10mmol/L）引物各1μL（20μmol/L），cDNA模板1μL，灭菌去离子水40μL，混匀并短暂离心后进行循环反应.反应条件为：94℃45s，61℃45s，72℃45s，共38个循环，末次循环结束后72℃延伸5min,4℃保存.PCR产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳观察，回收DNA条带，用赛百盛试剂盒按说明纯化扩增产物.124人bit1cDNA基因的克隆PCR扩增产物与pUC19载体均用EcoRI和BamHI37℃双酶切3h，酶切产物行10g/L琼脂糖凝胶电泳及凝胶DNA回收.人bit1基因片段与pUC19载体片段按5∶1摩尔比例，在T4

7、DNA连接酶催化下，于16℃连接12h.连接产物转化Top10感受态细胞，37℃振摇培养45min后涂布于LB平板（含氨苄青霉素100mg/L），37℃倒置培养36~48h.随机挑选6个白色菌落(蓝白筛选)，分别接种于5mL含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃振摇培养过夜，参照文献［3］以碱裂解法小量提取质粒DNA，经酶切及序列测定鉴定阳性克隆.阳性克隆质粒命名为pUC19Bit1.125人bit1cDNA基因