家蝇cctζ基因的cdna克隆、表达及表达模式研究

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1、中图分类号：R3单位代码：丨0660UDC:6I0学号：10660S120022学科专业代码i100103密级：公开贵阳医学院2015届硕士研宄生学位论文(科学学位）家蝇CCT?基因的cDNA克隆、表达及表达模式研究cDNACloningexpressionandexpressionpatternofCCTgeneinhousefly(Muscadomesticd)研究生：赵学军导师：吴建伟教授国果副教授年级:2012级专业：病原生物学贵阳医学院学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导F，独v/:进行研究.「.作所取得的成果。除了文中特

2、别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。除与外单位合作项目将予以明确方式规定外，本研究已发表与未发表成果的知识产权均归属贵阳K学院。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名（手写）：H导师签名（手写）：丨服___年厂月7L曰’厂年r月么多II学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全/解学校有关保留、使用学位论文的规定，

3、「彳意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电了•版，允许论文被查阅和借阅。本人授权贵阳医学院可以将本学位论文的全部或

4、部分内容编入有关数据库进行检索，吋以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属干（请在以下相应方框内打“V”）：1、保密□，在_年解密后适用本授权书。2、不保密作者fe名（f•写）5《乂)孝——导师签名（-T•写）：—祖年r月zz日丄。if年j〜月j

5、中图分类号：R3单位代码：10660UDC:610学号：10660S120022学科专业代码：100103密级：公开贵阳医学院2015届硕士研究生学位论文（科学学位）家蝇CCTζ基因的cDNA克隆、表达及表达模式研究cDNACloning,expressionandexpressionpa

6、tternofCCTgeneinhousefly(Muscadomestica)论文作者：赵学军指导教师：国果副教授申请学位：医学硕士培养单位：基础医学院学科专业：病原生物学研究方向：医学昆虫分子生物学研究起止日期：2012年12月至2014年12月论文评阅人：盲评答辩委员会主席：陈建平教授论文答辩日期：2015年5月19日二0一五年五月家蝇CCTζ基因的cDNA克隆、表达及表达模式研究专业：病原生物学硕士研究生:赵学军导师：吴建伟教授国果副教授【摘要】：目的:从家蝇的EST测序数据库中筛选获得家蝇的CCT(chaperonincontainingt-com

7、plexpolypeptide)基因MD-CCTζ，上传GenBank分析分子特性后，进行cDNA克隆、表达；探讨MD-CCTζ基因在家蝇不同组织和发育时期的时空表达模式；初步研究在不同病原微生物和热胁迫条件下家蝇3龄幼虫的MD-CCTζ基因表达谱的变化。方法:1、MD-CCTζ的序列分析及cDNA克隆、表达。从课题组前期构建的家蝇幼虫EST数据库中筛选得到家蝇的CCTζ基因序列，通过序列分析，预测其开放阅读框，采用BLAST、EXPASY等生物信息学网站分析预测MD-CCTζ基因编码蛋白的结构域，二级及三级结构等；从NCBI上下载其他物种CCTζ基因的氨基

8、酸序列，借助MEGA6.0软件采用邻接法构建系统进化树;根据其cDNA序列设计引物，PCR扩增MD-CCTζ基因，将目的基因与表达载体PEASY-E1构建重组质粒，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，选择合适温度、时间使用IPTG诱导重组蛋白，重组蛋白使用His·Tag融合蛋白试剂盒纯化。2、家蝇CCTζ基因的时空表达分析。分别收集家蝇生活史各发育阶段不同虫态（卵、1龄幼虫、2龄幼虫、3龄幼虫、蛹），成虫不同性别（雌虫和雄虫）的虫体，提取总RNA后并逆转录为cDNA,以GAPDH基因为内参基因，采用实时荧光定量PCR（RealTimePCR）技术检测MD-C

9、CTζ基因不同发育时期的表达差异；解剖家蝇3龄幼虫，选择幼虫的六种具有典型特征的组织器官（脂肪体、唾液腺、中肠、气管、马氏管和体壁）。提取相应组织的总RNA并转录为cDNA。采用RealTimePCR检测MD-CCTζ基因的空间表达差异。3、MD-CCTζ基因在家蝇3龄幼虫胁迫条件下的功能初探。分别将定量的不同病原微生物（白色念珠菌、大肠杆菌和及金黄色葡萄球菌）采用注射法导入到家蝇3龄幼虫体内，采用RealTimePCR检测诱导后不同时间点（3h、6h、12h、18h、24h、36h、48h）CCTζ基因表达水平的变化。将3龄幼虫42℃热胁迫，采用RealT

10、imePCR检测胁迫（0h、15min、30min、