家蝇β-葡萄糖苷酶基因的克隆及重组表达研究

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1、贵阳医学院2013届博士学位论文《中国图书资料分类法》分类号Q965单位代码：10660学号：10660B100006贵阳医学院博士学位论文家蝇β-葡萄糖苷酶基因的克隆及重组表达研究培养单位:贵阳医学院研究生：张姝导师：吴建伟教授专业：病理学与病理生理学研究方向：昆虫免疫学年级：2010级2013年5月15日贵阳医学院2013届博士学位论文目录中文摘要……………………………………………………………..…..1英文摘要………………………………………………………………..3前言………………………………………………………

2、……..........6第一章家蝇β-葡萄糖苷酶基因的克隆及生物信息学分析………………………………………………………………………....81.1材料………………………………………………………....…….91.2方法………………………………………………………….....101.3结果………………………………………………………….......191.4讨论……………………………………………………………...32第二章家蝇β-葡萄糖苷酶基因的体外原核表达及其表达产物的活性检测………………………………………………………

3、………….341.1材料……………………………………………………...….……341.2方法…………………………………………………………….371.3结果………………………………………………………….......461.4讨论……………………………………………………………...57第三章家蝇β-葡萄糖苷酶基因的真核表达及其表达产物的活性检测……………………………………………………………………….591.1材料……………………………………………………..………591.2方法…………………………………………………………

4、….611.3结果………………………………………………………….......681.4讨论……………………………………………………………...79贵阳医学院2013届博士学位论文结论……………………………………………………………………..80参考文献………………………………………………………………82综述……………………………………………………………………88在读期间发表文章…………………..………………………………..105致谢……………...………………………………………………...106略缩词表…………………

5、…………………………………………..107贵阳医学院2013届博士学位论文家蝇β-葡萄糖苷酶基因的克隆及重组表达研究专业：病理学与病理生理学博士生：张姝导师：吴建伟教授中文摘要目的克隆家蝇内源性β-葡萄糖苷酶（beta-glucosidase，BG）基因、建立原核表达和真核表达体系，检测表达产物活性，了解家蝇内源性BG酶特点，为深入研究家蝇BG酶的独特性，进一步解释家蝇极强环境适应能力和发现新的种群控制措施提供分子生物学基础，为发现新的有效纤维素酶体系提供基础数据。方法1.以草地贪夜蛾等结构信息相对完整且研究较为透

6、彻的6种代表性昆虫的β-葡萄糖苷酶基因序列为参照对象，进行氨基酸同源性分析，设计简并引物在家蝇cDNA中扩增出家蝇β-葡萄糖苷酶基因(Muscadomesticabeta-glucosidasegene,bg-1)保守区域。2.利用5’和3’RACEcDNA末端快速扩增技术从家蝇cDNA中克隆bg-1基因的3’端和5’端cDNA序列，拼接得到bg-1基因的全长cDNA序列并对其进行生物信息学分析。3.根据所得bg-1基因的cDNA序列设计引物扩增bg-1基因成熟肽的基因片段，进而分别采用原核表达载体pET-28a(

7、+)和pEGX-4T-1构建原核表达体系并在大肠杆菌（E.coli）BL21(DE3)中诱导表达bg-1基因的融合蛋白（Muscadomesticabeta-glucosidasefusionprotein，BG-1）。4.利用真核表达载体pPICZaA构建表达体系在酵母细胞GS115中表达bg-1基因，并利用制备的多克隆抗体进行免疫印迹对表达蛋白进行验证。5.采用七叶苷平板显色法和DNS法检测各表达体系诱导表达BG-1蛋白的酶活性，并对其性质进行初步的分析。结果1.利用简并PCR技术从家蝇体内克隆得到了长度为19

8、33bp家蝇bg-1基因的全长cDNA序列，推导其为562个氨基酸残基组成的蛋白多肽，将其登录到GenBank，获得登录号：JX460804。生物信息学分析结果显示，所得bg-1基因的融合蛋白具有信号肽，其成熟肽的理论分子量为65020.6Da，等电点为8.16，半衰期大于20h，蛋白性质稳定。脂肪族指数为76.83，为亲水性蛋白。2.分别构建了家蝇BG酶的