人酪氨酸酶相关蛋白┐2的cdna克隆及表达论文

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1、人酪氨酸酶相关蛋白┐2的cDNA克隆及表达论文.freelantyrosinasere-latedprotein2（TRP-2）andexpressthecorrespondingpro┐tein.METHODSTotalRNAculturedhu-manpigmentalcellsandmRNAplifytheTRP-2codingre-gion.ThePCRproductidandsequenced，thensubclonedintovectorpGEX-4T-1.TheTRP-2proteined;FusionexpressingvectorofpGEX-4T-1/TRP-2anTRP

2、-2geneissuccessfullyclonedandTRP-2/GSTfusionexpressingvectorisconstructed.TRP-2/GSTfusionproteiniscorrectlyexpressedinE.coli.0引言酪氨酸酶相关蛋白-2（tyrosinaserelatedpro-tein-2，TRP-2）DHI-2羧酸转化过程中发挥作用.TRP-2是一种胞质抗原与白癜风的病理机制有关，在白癜风、恶性黑素瘤及接受特异性免疫治疗而产生色素减退的患者血清中抗TRP-2IgG滴度较高.此外，抗TRP-2自身抗体与TRP-2或酪氨酸酶均可发生反应，即TRP-2与

3、酪氨酸酶为交叉抗原.因此，克隆并翻译TRP-2的cDNA序列，可为进一步探索酪氨酸酶与TRP-2的交叉抗原表位及白癜风的发病机制和治疗打下基础.1材料和方法1.1材料人黑素细胞系、克隆质粒pUC19、表达质粒pGEX-4T-1和菌株DH5α由第四军医大学西京医院皮肤科实验室保存;总RNA提取试剂盒购于华美公司;BamHI，EcoRI，T4DNA连接酶购于TaKaRa公司;TaqDNA聚合酶，反转录试剂盒、胶回收试剂盒购于Promega公司;谷胱甘肽巯基转移酶（GST）纯化试剂盒购于CloneTech公司.1.2方法根据载体多克隆酶切位点及TRP-2的序列，设计引物.其中引物5’端中引入Bam

4、HI酶切位点，3’端引入EcoRI酶切位点.引物由北京SBS公司合成，引物的序列为（下划线为酶切位点）:p15’CG---GGATCC---ATGGGCTATAATTGTGGAGACTGCA3’p25’CG---GAATTC---GGCAAAGTTCCAGTAGGGCAAA3’;按试剂盒说明书方法操作，从培养的人黑素细胞中提取总RNA，将mRNA反转录合成cDNA.目的基因片段常规PCR扩增，反应条件为:95℃预变性2min后加入TaqDNA聚合酶1U，按94℃30s，55℃30s，72℃40s，进行35个循环，最后在72℃延伸10min.以HPV重组质粒为反应体系的阳性对照，三蒸水为空白对

5、照，以TRP-1重组质粒为阴性对照.PCR产物进行12gL-1琼脂糖电泳，检测扩增产物片段的大小.产物经回收后，以BamHI，EcoRI双酶切，回收目的片段后定向插入经同样双酶切的pUC19载体中，以T4DNA连接酶连接.重组后的质粒转化感受态大肠杆菌DH5α，提取质粒后以BamHI，EcoRI双酶切，12gL-1琼脂糖电泳鉴定.重组质粒由上海生工生物工程公司完成测序.目的基因片段的亚克隆:将测序后的重组载体以BamHI，EcoRI双酶切，切下的片段插入经同样双酶切的pGEX4T-1载体中，转化感受态细胞DH5α.TRP-2与GST融合蛋白的诱导表达:加入终浓度为0.4mmolL-1的IPT

6、G，于37℃分别诱导培养2，3和4h，按常规方法收菌，进行SDS-PAGE.用薄层扫描仪分析该蛋白占菌体总蛋白的含量［1］.表达蛋白的可溶性鉴定:以超声波破碎细胞，收集表达菌体后，分别取相同浓度的50μL上清及沉淀，进行SDS-PAGE，观察表达条带是在上清中还是在包涵体中.表达蛋白的纯化用Clotech公司的GST融合蛋白纯化柱，按操作说明操作.2结果2.1TRP┐2基因的克隆及测序12gL-1琼脂糖凝胶电泳显示，扩增出1条核酸片段，与预计的大小（457bp）基本一致（Fig1）.TRP-2基因的扩增片段纯化后与pUC19载体连接，经BamHI和EcoRI双酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳显示切出

7、大小约447bp的重组片段（Fig2），表明系阳性克隆.测序结果与已知序列完全一致.2.2TRP┐2/GST融合表达载体的构建GST融合表达载体的构建通过粘端的亚克隆进行［2］，克隆质粒pUC19/TRP-2经BamHI和EcoRI双酶切后，释放447bp片段，将此片段与BamHI和EcoRI双酶切线性化的原核表达载体pGEX-4T-1连接.转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，构建的重组质粒经BamHI和EcoR