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《蛋白酪氨酸磷酸酯酶4a2基因的克隆、表达及活性鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、蛋白酪氨酸磷酸酯酶4A2基因的克隆、表达及活性鉴定程超，郭爱林，巫国勇，吴伟康 罗红鹤，钟佛添【摘要】【目的】获取人蛋白酪氨酸磷酸酯酶4A2（PTP4A2）基因并高效表达纯化，对于产物的体外活性进行测定。【方法】用RT-PCR技术，从肝癌细胞系HepG2的总RNA中，获得编码PTP4A2基因功能片段的DNA。测序后，通过酶切亚克隆至表达载体ｐGEX-4T-2，构建重组表达载体，并导入大肠杆菌E.coliBL21中，IPTG诱导表达重组的GST融合蛋白。对重组融合蛋白过谷胱甘肽琼脂糖柱进行纯化，acia公司
2、；pGEMTeasy载体、RT-PCR试剂盒及Tvector试剂盒、各种限制性内切酶、连接酶及TaqDNA聚合酶均为美国Promeca公司产品;DNA酶和高纯质粒提取试剂盒为德国Qiagen公司产品；IPTG,DTT,DTE,胱胺、谷胱甘肽琼脂糖及还原性谷胱甘肽,色谱级乙腈，色谱级去离子水，三氟乙酸，芥子酸均为Sigma公司产品;去磷酸化底物多肽R-R-L-I-E-D-A-E-pY-A-A-R-G，美国UBI公司产品，抗GST抗体及arker购自珠海百奥生物技术有限公司。其余一般化学试剂均为国产分析纯。表
3、面增强激光解吸电离质谱仪（SELDI-TOF-MS）PBSII及金质芯片，美国Ciphergen公司制造。1.2RNA的抽提弃去培养瓶中的培养液，流干。加入适量Trizol裂解细胞，在冰上放置5min；将裂解产物分装到1.5mL的Eppendof管中，再加入200uL的氯仿，混匀，冰上放置5min；1200×g离心15min，吸上清液于另一离心管中，加入等体积的异丙醇，冰上放置15min。1200×g离心15min，沉淀RNA去上清，体积分数70％乙醇洗涤沉淀，室温风干，加DEPC处理双蒸水溶解。10g/
4、L琼脂糖凝胶检测质量，随后用紫外分光光度计测定RNA的浓度和纯度，置于-70℃冰箱中备用。1.3PTP4A2基因的扩增以提取的RNA为模板进行RT-PCR,扩增PTP4A2全长的ｃDNA编码片段，引物序列如下：5′端引物：ggatccATGAACCGTCCAGCCC，3′端引物：ctcgagCTACTGAACACAGCAATGCC。48℃50min反转录。首先于94℃变性5min；然后92℃，30s；56℃，30s；72℃，60s共循环30次；最后1次循环完成后于72℃延伸5min。1.4RT－PCR产物
5、的克隆与鉴定回收RT－PCR产物,与质粒pGEMTEasy进行连接反应，转化感受态DH5а,挑取白色菌落进行酶切鉴定,所获阳性克隆命名为pGEMPTP4A2,送至上海生工公司进行测序。经BamHⅠ,XhoⅠ双酶切后与经同样酶切的pGEX-4T-2进行连接反应,挑选的阳性克隆命名为pGEXPTP4A2。1.5目的蛋白的诱导表达工程菌在含氨苄青霉素(100ｍｇ/L)的LB培养基中过夜培养，按10%的接种量进行转接，250r/min，37℃摇菌至Ａ600=1.0,加入异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.
6、5mmol/L，37℃继续通气培养4～5h。取1.5mL菌液,10000×ｇ离心30s收集菌体,菌体加入H2O60μL，剧烈振荡混匀，再加入4×样品缓冲液20μL，100℃，5min；10000×ｇ离心5min；120g/LSDS－PAGE电泳检测，预计相对分子质量Mr=45000处有明显的蛋白表达。大规模培养细菌，诱导表达目的蛋白，收集菌体，超声破菌。离心后将上清和沉淀分别制样，进行SDS－PAGE。可溶的目的蛋白直接应用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析柱进行亲和层析纯化以包涵体形式存在的表达产物。N-十二烷基肌
7、氨酸钠将沉淀蛋白质变性过夜,经缓慢透析去除N-十二烷基肌氨酸钠,令蛋白复性后,用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析柱对目的蛋白进行亲和层析纯化。抗GST抗体及LGlutathioneSepharose4B加入柱子中,用10倍体积的PBS洗去保护液至柱体平衡,柱体平衡后,分别加入15mL的表达液(调节流量为0.15mL/min过柱,UV280nm、UV215nm监测洗脱、吸附情况),使蛋白质充分吸附。PBS洗涤层析柱至重新平衡,将PBS更换为超纯水洗柱至将目的蛋白洗出。(责任编辑：admin)1.7表达产物的PTP4A
8、2，用高纯质粒提取试剂盒提取质粒，测序结果表明所扩增的PTP4A2与GeneBank公布的序列相符。2.2表达载体的构建pGEMPTP4A2经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切后与经同样酶切的pGEX-4T-2进行连接反应后,转化感受态细胞，挑选的克隆进行双酶切鉴定,10g/L琼脂糖电泳显示约4900bp大小片段的载体片断和约500bp的目的基因(图1)。阳性克隆命名为pGEXPTP4A2。2.3重组蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化将pG
