蛋白酪氨酸磷酸酯酶4A2基因的克隆、表达及活性鉴定【大学临床医学毕业论文设计，精选】

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1、临床医学论文■蛋白酪氨酸磷酸酯酶4A2基因的克隆・表达及活性鉴定作者:程超，郭爱林，巫国勇，吴伟康罗红鹤，钟佛添【摘要】【目的】获取人蛋白酪氨酸磷酸酯酶4A2(PTP4A2)基因并高效表达纯化，对于产物的体外活性进行测定。【方法】用RT-PCR技术，从肝癌细胞系HepG2的总RNA中，获得编码PTP4A2基因功能片段的DNA。测序后，通过酶切亚克隆至表迖载体pGEX・4T・2，构建重组表迖载体，并导入大肠杆菌E.coliBL21中，IPTG诱导表达重组的GST融合蛋白。对重组融合蛋白过谷胱廿肽琼脂糖柱进行纯化，western印记进行

2、鉴定，质谱检测蛋白分子量。通过其对底物磷酸多肽的去磷酸化反应，鉴定其活性。【结果】获得编码肝癌细胞PTP4A2(全长氨基酸)的基因序列，测序结果与已发表的基因序列相一致。重组GST融合蛋白经western分析，在相对分子质量Mr二45000处，有特异的蛋白条带。重组蛋口经谷胱廿肽琼脂糖柱进行纯化后，得到了高纯度的融合蛋口，质谱检测其分子量为45470.6。底物多肽去磷酸化反应表明纯化产物具有较强活性。【结论】成功克隆人PTP4A2基因，并在E.coliBL21中高效表达，亲和层析后获得高纯度GST融合蛋白，质谱检测分子量与预期结果一

3、致，纯化产物具有蛋白磷酸酯酶活性。【关键词】蛋白酪氨酸磷酸酯酶；基因克隆；表达；纯化；质谱[JSUNYat-senUniv(MedSci),2007,28(2):137-141]酪氨酸蛋白磷酸酯酶对细胞生长、分化、代谢、细胞周期调节和细胞骨架等有重要的调节功能。它特异性地催化蛋白质酪氨酸残基上脫磷酸反应，调控细胞内蛋白质酪氨酸残基的磷酸化程度［1］。酪氨酸蛋白磷酸酯酶除催化结构域外，还包括亚细胞定位结构域及底物识别和调控结构域［2］。酪氨酸蛋白磷酸酯酶4A2(proteintyrosinePhosphatasetype1VA2，PT

4、P4A2)，又名肝细胞再生磷酸酯嗨2(phosphataseofregeneratingliver2,PRL-2)，是一类新发现的小分子酪氨酸蛋白磷酸酯酶，包括PTP4A1，PTP4A2，PTP4A3。它们参与了细胞生长的调控［3］，增殖［4］，细胞的浸润和肿瘤的转移［5］。PTP4A2与肿瘤细胞的恶性转化密切相关，很有可能是一种癌基因［6］。为了进一步硏究PTP4A2的功能，制备相应抗体及寻找抗肿瘤药物，我们尝试克降并表达PTP4A2基因，对于表达产物进行了纯化和活性鉴定。1材料和方法1.1材料和试剂肝癌细胞系HepG2本教硏室保

5、存寡聚核昔酸引物由上海生工公司合成；RNA提取试剂Trizol购自美国Gibco公司;pGEX4T-2质粒购自瑞典Pharmacia公司；pGEMTeasy载体、RT-PCR试剂盒及Tvector试剂盒、各种限制性内切酶、连接酶及TaqDNA聚合酶均为美国Promeca公司产品；DNA酶和高纯质粒提取试剂盒为徳国Qiagen公司产品；IPTG,DTT,DTE，胱胺、谷胱甘肽琼脂糖及还原性谷胱甘肽，色谱级乙睛，色谱级去离子水，三氟乙酸，芥子酸均为Sigma公司产品;去磷酸化底物多肽R-R-L-1-E-D-A-E-pY-A-A-R-G，

6、美国UB1公司产品，抗GST抗体及western试剂盒购自美国NEB公司，蛋白marker购自珠海百奥生物技术有限公司。其余一般化学试剂均为国产分析纯。表面增强激光解吸电离质谱仪(SELDI-TOF-MS)PBSII及金质芯片，美国Ciphergen公司制造。1.2RNA的抽提弃去培养瓶中的培养液，流干。加入适量Trizol裂解细胞，在冰上放置5min；将裂解产物分装到1.5mL的Eppendof管中，再加入200uL的氯仿,混匀、冰上放置5min；1200xg离心15min?吸上清液于另一离心管中，加入等体积的异丙醇，冰上放置15

7、min°1200xg离心15min，沉淀RNA去上清，体积分数70%乙醇洗涤沉淀，室温风干，加DEPC处理双蒸水溶解。10g/L琼脂糖凝胶检测质量，随后用紫外分光光度计测定RNA的浓度和纯度，置于・70°C冰箱中备用。1・3PTP4A2基因的扩增以提取的RNA为模板进行RT-PCR,扩增PTP4A2全长的cDNA编码片段，引物序列如下-5'端引物:ggatccATGAACCGTCCAGCCC，3'端引物:ctcgagCTACTGAACACAGCAATGCC。48°C50min反转录。首先于94°C变性5min；然后92°C，30s；

8、56°C，30s；72°C，60s共循环30次；最后1次循环完成后于72°C延伸5min°1.4RT-PCR产物的克隆与鉴定回收RT-PCR产物,与质粒pGEMTEasy进行连接反应，转化感受态DH5a,挑取白色菌落进行甌切鉴定，所获