重组小鼠gAcrp30的基因克隆、表达及生物活性研究

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1、第一军医大学硕士学位论文重组小鼠gAcrp30的基因克隆、表达及生物活性研究姓名：王乐媛申请学位级别：硕士专业：分子免疫学指导教师：王小宁20030606第一军医大学硕士论文(王乐嫒)小鼠gAcrp30的基因克隆、表达及生物活性研究ATPbpcDNADNAdNTPDTTEBEDTAgAcrp30GSH／GSSGkbKDorKDaLB2．MEIPTGmI蝌APAGEPBSPCRPEGRNARNaseSDS英文缩略词表adeuosinetriphophatebasepaircomplementaryDNAdeoxyribonucleicaciddeoxynucleotidetri

2、phosphatcdithiotheitolethidiumbromideethyleuediaminotetmaceticacidAdipocytecomplememt—relatedproteingolubinreducedoxidedglutathionekilobaseskilodaltouLuria-Bertanimedium2-mereaptoethanolisopropyl—thiogalactopyranosidemesseugerRNA+polyacrylaminegelelectrophoresisphosphate-bufferedsalinepolym

3、erasechainreactionpolyethyleneglycolribonucleicacidribonucleicacidsodiumdodecylsulphate腺苷三磷ad$ol{-互补DNA脱氧核糖核苷酸脱氧三磷酸核苷二巯基苏糖醇溴化乙锭乙二氨四乙酸脂肪细胞补体相关蛋白球蛋白区还原型／氧化型谷光甘肽千adS．千道尔顿LB培养基D一巯基乙醇异丙基一D—D硫代半糖苷信使RNA聚丙烯凝胶电泳磷酸缓冲盐水多聚酶链式反应聚乙二醇核糖核酸核糖核酸酶十二烷基磺酸钠第一军医大学分子免疫研究所第l页共55页第一军医火学硕士论文(王乐嫒)小鼠gAcrp30的基因克隆、表达及生物活

4、性研究SS1’risX-galUhmlnSecsinglestrand单链N·tris(hydroxymethyl)amimomethanN一三羟甲基氨基甲。烷5-bromo—chloro—indoyl—D一5一溴-4-氯吲哚一Dgalactoside-D-半乳糖苷unit单位hourmlnutesecond小时分钟秒第一军医人学分于免疫研究所第2页共55页第一军医人学顾I。论文(王乐嫒)小鼠gAcrp30的基因克隆、表达及生物活性研究中文摘要脂肪细胞补体相关蛋白gAcrp30是已分化的脂肪细胞特异分泌的蛋白质因子，主要做用是促进脂肪细胞新成代谢，分子量25kDa，有文献报导

5、，无论是从血浆中提取的，还是利用基因工程手段从大肠杆菌中表达制备的人不含信号肽的Acrp30—gAcrp30，均能显著地诱导小鼠肌体内游离脂肪酸在肌肉中氧化，并相应降低体重一从而表明gAcrp30是人们梦寐以求的一类激素之一，其作用机理是因为它能将信号从脂肪组织传导至肌肉。促使肌肉组织大量燃烧脂肪产生能量从而减少脂肪的储存。而传统的减肥的方法有两种：一、使肠壁的吸收减少，通过节食来完成，这样就会影响到肠壁正常物质的吸收；二、过加大运动量的方法，并在运动后少量进食，这对于一些患糖尿病和心脏病的病人无疑是不可行的，况且肥胖病人有大多数罹患这些疾病。如何解决这些问题，gAcrp30

6、可为一种好的方法。本研究通过RT-PCR技术从小鼠脂肪细胞中克隆了不含信号肽序列的全长小鼠gAcrp30eDNA，序列测定表明本研究已克隆的gAcrp30序列同国外报道的序列一致。将不含信号肽序列的小鼠Acrp30基因克隆至原核表达载体pET一21a中，构建成重组原核表达质粒pET一21a／gAcrp30。将该重组质粒导入宿主菌BL21，经IPTG诱导后获得高水平表达(目标蛋白表达>2096)。经SDS-PACE分析表明：表达产物主要为不可溶性的蛋白质聚集体一包涵体。将已收集的菌体经超声破碎后，2mol／L尿素，1％吐温一80洗涤后，离心收集包涵体。该包涵体经8mol／L尿素

7、溶解变性后，采用透析和稀释二种复性方法进行复性比较，复性样品经阴离子交换层析Q-SepheroseFastFlow和Q-Sepherosehighperformance(h．P．)二步阴离子交换层析得到单一条带，分子量为25KDa。免疫印迹结果表明，通过表达和纯化所获得的蛋白为小鼠gAcrp30。上述研究结果将为进一步研究小鼠gAcrp30的理化性质及人gAcrp30的研究奠定基础。第一军医人学分子免疫研究所第3页共”页第一军医大学烦I：论文(王乐嫒)小鼠gAerp30的基因克隆、表达及生物活性研究肥胖