重组人乳铁蛋白在转基因克隆牛乳中的表达、纯化及生物活性研究

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1、分类号：单位代码：10019密级：学号：B040393博士学位论文重组人乳铁蛋白在转基因克隆牛乳中的表达、纯化及生物活性研究Expression,PurificationandCharacterizationofRecombinantHumanLactoferrinintheMilkofTransgenicClonedCattle研究生：杨鹏华指导教师：李宁教授申请学位门类级别：理学博士专业领域名称：生物化学与分子生物学研究方向：动物分子遗传学所在学院：生物学院2009年6月GraduateDissertationExpression，PurificationandCharacterizati

2、onofRecombinantHumanLactoferrinintheMilkofTransgenicClonedCattleGraduate:YangPenghuaMajor:BiochemistryandMolecularBiologySupervisor:Prof.LiNingChinaAgriculturalUniversityBeijing100193June2009本研究得到以下项目的资助：国家“863”计划生物反应器重大专项国家自然科学基金ThisworkwassupportedbyStateHigh-techResearch＆DevelopmentProgramNationa

3、lNaturalScienceFoundationProgram中国农业大学博士学位论文独创性声明独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：年月日关于论文使用授权的说明本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印

4、或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日中国农业大学博士毕业论文摘要摘要在过去的二十多年中，随着生物技术的不断进步与完善，转基因研究已经从原核生物表达体系发展到高等哺乳动物表达体系。其中乳腺生物反应器的建立不仅具有很高的理论研究价值而且具有广阔的商业应用前景。利用乳腺生物反应器生产具有食用或药用价值的蛋白会给社会带来巨大的经济效益。但是重组蛋白在表达过程中的异常会导致其活性的丧失，因此对重组蛋白的理化性质和生物活性的分析与鉴定就显得尤为重

5、要。本实验室通过克隆和转基因技术成功制作了人乳铁蛋白转基因克隆牛。本研究的目的就是对转基因牛乳中人乳铁蛋白的表达进行鉴定，建立一种从转基因牛乳中纯化重组人乳铁蛋白的方法，并对其理化性质和生物学功能进行研究。本研究获得了两头高水平表达重组人乳铁蛋白的转基因克隆牛。它们的表达水平分别为2.529±0.212mg/ml和3.429±0.417mg/ml。通过转基因牛乳的乳成分分析，我们发现转基因牛乳与常乳在乳脂、总蛋白、乳糖和干物质的含量上没有明显变化。应用双向电泳和质谱技术分析转基因牛乳中总蛋白的表达情况发现，重组人乳铁蛋白在转基因牛乳中的表达量很高，而且它并没有影响乳中其它蛋白的表达。TM本研究

6、建立了一种从转基因牛乳中纯化重组人乳铁蛋白的方法。用HiLoad16/10SPSepharoseHighperformance色谱柱，采用0.4M-1.0MNaCl线性浓度洗脱，纯化得到纯度达到95％以上的重组人乳铁蛋白，最高回收率为76.2%。重组人乳铁蛋白的分子量为79494道尔顿，比天然人乳铁蛋白的分子量小2000道尔顿左右，经PNGaseF消化研究表明，这种差异主要是由于不同的N糖基化形式造成的。N端测序的结果表明，重组人乳铁蛋白在成熟的过程中其信号肽被正确的切割了。重组人乳铁蛋白具有与天然人乳铁蛋白相似的生物学活性。胰蛋白酶和胃蛋白酶消化的结果表明，重组人乳铁蛋白和天然人乳铁蛋白对这

7、两种酶的裂解属性是相似的。重组与天然人乳铁蛋白在体外经过铁溶液的处理后具有结合铁离子的能力，而且这种铁结合的能力与环境中的pH值有直接关系。当pH下降到4.5时，铁离子开始从蛋白中释放出来。在pH2.5时，蛋白几乎全部释放掉自身结合的铁离子。重组人乳铁蛋白具有与天然人乳铁蛋白相似的抑菌活性。本5研究结果表明当大肠杆菌浓度为1×10CFU/ml时，加入终浓度为5mg/ml的重组人乳铁蛋白能明显抑制细