乳铁蛋白的仿生亲和纯化研究

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1、上海交通大学硕士研究生学位论文乳铁蛋白的仿生亲和纯化研究摘要人乳铁蛋白是一种分子质量为70～80kD的糖蛋白，属转铁蛋白家族成员，具有广谱抗菌，抗病毒，抗肿瘤，调节机体免疫反应等多种生物活性，在功能营养食品和医疗保健等方面具有广阔的应用前景。过去，因人乳铁蛋白来源有限，严重限制了其商业开发。随着动物转基因技术的发展，中国农业大学李宁教授研究团队构建了牛乳腺生物反应器，在牛乳腺中高量表达重组人乳铁蛋白，牛乳中人乳铁蛋白浓度达2.529±0.212mg/mL～3.429±0.417mg/mL，有可能实现重组人乳铁蛋白在牛乳腺中的规模生产。本课题研究目的是针对乳铁蛋白

2、研究开发仿生亲和配体，仿生亲和分离材料以及建立从转基因牛乳中大规模纯化重组人乳铁蛋白的工艺。本研究首先设计合成了一个仿生亲和分离材料库，含322中不同结构的配体；利用筛选方法得到了特异性结合重组人乳铁蛋白的β-丙氨酸亲和配体，其结构为β-丙氨酸经三氯三嗪间隔臂共价偶联于氨基活化的Sepharose-6B上。通过对固定化β-丙氨酸纯化重组人乳铁蛋白的pH和离子强度条件进行优化，确定介质对重组人乳铁蛋白的最佳结合条件为：50mMTris-HCl/0.1MNaCl,pH7.0；最佳洗脱条件为：0.1MGly-HCl,pH2.4。纯化得到的重组人乳铁蛋白纯度>95%，回

3、收率达81.6%，固定化β-丙氨酸对重组人乳铁蛋白的最大吸附量达65.6mg/g干介质，并且能够耐受NaOH溶液的清洗与再生。经MALDI-TOF鉴定，所纯化的蛋白即为重组人乳铁蛋白。N端测序结果表明，重组人乳铁蛋白N端氨基酸序列为GRRRRSVQW，与天然人乳铁蛋白相同。-I-上海交通大学硕士研究生学位论文对重组人乳铁蛋白最重要的两个生物学活性进行了鉴定。在体外经铁溶液处理后，重组与天然人乳铁蛋白均能结合铁离子，而且这种铁结合能力与环境中的pH直接相关。当pH降至4.5时，铁离子开始从蛋白中释放出来。在pH2.0时，蛋白几乎全部释放掉自身结合的铁离子。这表明重

4、组人乳铁蛋白具有与天然人乳铁蛋白类似的铁结合与释放能力。重组人5乳铁蛋白具有抑菌活性，当大肠杆菌菌浓度为1×10CFU/mL时，加入终浓度为5mg/mL的重组人乳铁蛋白能明显抑制细菌的生长。除重组人乳铁蛋白外，固定化β-丙氨酸可从人乳，天然牛乳和羊乳中纯化乳铁蛋白，表明该介质可用于不同种属乳铁蛋白的亲和纯化。以上结果表明，利用固定化β-丙氨酸亲和介质可以大规模纯化具有天然生物学活性的重组人乳铁蛋白，并且可以应用于从人乳，天然牛乳和羊乳等乳汁中纯化不同种属的乳铁蛋白。关键词：转基因牛乳，重组人乳铁蛋白，仿生亲和配体，亲和纯化-II-上海交通大学硕士研究生学位论文A

5、ffinityPurificationofLactoferrinbySyntheticligandABSTRACTHumanlactoferrinisa70~80kDairon‐bindingglycoproteinofthetransferringfamilywithantibacterial,antifungal,antiviral,antitumorandimmunomodulatingactivities.Owingtoitsimplicationsinthesefunctions,humanlactoferrinhasbeenconsideredawi

6、devarietyofapplicationsinfoodandhumanhealthcare,butitsapplicationsarerestrictedbecauseofthelimitedsource.Recently,acattlemammaryglandbioreactorexpressingrecombinanthumanlactoferrinhasbeengeneratedbyaresearchgroupledbyDr.LiNingatChineseAgriculturalUniversity,thelevelofrecombinanthuman

7、lactoferrinexpressedbytransgeniccattlecouldreachashighas2.529±0.212mg/mL～3.429±0.417mg/mL,whichprobablyprovidedapowerfulapproachtoachievelarge-scaleproductionofrecombinanthumanlactoferininthemilkoftransgeniccows.Thepurposeofthisstudyistoestablishanovelaffinityprotocolforlarge-scalepu

8、rificationof