重组人era蛋白的可溶性表达、 纯化及生物学活性测定

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1、重组人Era蛋白的可溶性表达、纯化及生物学活性测定：吴元明,张晓楠,邢小红,张俊杰,陈南春,陈苏民【摘要】　　目的:为了得到可溶性表达的人Era（hEra）蛋白,并检测其生物学活性。方法:把人era的cDNA基因从pUC19质粒亚克隆入表达质粒pMALp2x中。pMALhEra转化大肠杆菌TB1,用异丙基硫代βD半乳糖苷（IPTG）诱导表达。结果:pMALhEra载体表达的融合蛋白是以可溶状态存在,表达量占菌体总蛋白的23.9%。再利用直链淀粉亲和色谱柱对表达的融合蛋白进行纯化,接着用

2、因子X将融合部分切除,但切除后的hEra蛋白不稳定,随着时间的延长而被降解。活性测定结果表明人Era蛋白能与GTP结合,并具有GTP酶的活性。结论:可溶性表达了人Era蛋白,并用体外实验证实人Era蛋白是一种G蛋白,这对人era基因的功能研究具有重要意义。【关键词】人Era可溶性表达生物活性测定　　[Abstract]AIM:ToprepareasolublehumanEra(hEra)proteinandtomeasureitsbioactivity.METHODS:HumaneracDNAge

3、nefrompUC19plasmididpMALp2x.pMALhEra.Thefusedproteinmadeup23.9%ofthetotalcelllysate.ItyloseaffinitychromotographyanddigestedentainedhEraproteine.TheactivityassayshoanEraproteincanbeexpressedinasolubleformandithasbeenprovedtobeakindofGproteinbytheexp

4、erimentsinvitro.Thestudyisimportanttofurtherresearchintothefunctionofhumaneragene.　　[KeyanEra;solubleexpression;bioactivityassay　　era基因是1986年在大肠杆菌中发现的,Era与人及酵母的Ras蛋白有部分相似之处,命名为大肠杆菌Ras样（E.coliRaslike）基因[1]。era基因在原核生物中普遍存在,在真核生物如蠕虫、小鼠、人、植物中也存在与细菌era高度同

5、源的基因。Era蛋白是小G蛋白家族的新成员,和其他小G蛋白不同的是,其羧基端含有一个KH结构域。实验发现Era蛋白可以特异地与16SrRNA结合[2],这可能与其含有的KH结构域有关。Sharma等[3]通过电镜技术在嗜热栖热菌细胞内观察到30S和Era蛋白的复合体,接着Inoue等[4]又利用细菌突变技术说明Era参与了细菌的核糖体生物合成。era是大肠杆菌中可以正常表达的基因,但表达水平极低。遗传学实验证实era基因与细胞周期和细胞分裂有关,是细菌生存繁殖所必需的重要基因。　　陈苏民等相继克

6、隆了人及小鼠全长的eracDNA基因。人eracDNA基因全长约2.2kb,含长度为1038bp的开放读框,编码346氨基酸的蛋白质。人Era（hEra）与大肠杆菌Era(eEra)蛋白全序列比较,有31%相同、53%相似。同样,hEra也是由N端的GTPase结构域和C端KH结构域所构成。有报道称哺乳动物的Era可能是一个凋亡调节因子[5],但其具体功能还不清楚。本研究我们旨在得到可溶性表达的人Era(hEra)蛋白,并检测其生物学活性。　　1材料和方法　　1.1材料pMALp2x和TB1

7、菌种为本实验室保存。限制性内切酶,异丙基硫代βD半乳糖苷(isopropylβDthiogalactopyranoside,IPTG),DL2000DNAmarker购自TaKaRa公司。DNA片段的回收试剂盒:NucleoTrapTMNucleicAcidpurificationKits购自CLONTECH公司。直链淀粉树脂,麦芽糖结合蛋白（maltosebindingprotein,MBP）,BSA为NEB公司产品。α32PGTP为北京亚辉生物医学工程公司产品。塑基薄层析片PEI

8、celluloseF购自MachereyNagel公司,硝酸纤维素膜购于华美公司。　　1.2方法　　1.2.1pMALhEra表达载体的构建用BamHI和PstI两个酶切位点将pUC19hEra中的hera基因片段亚克隆入pMALp2x载体,然后转化TB1感受态细胞。挑取单个菌落,提取质粒后经酶切鉴定,阳性质粒命名为pMALhEra[6]。　　1.2.2人eracDNA基因在大肠杆菌中的表达将含重组表达质粒pMALhEra的单个菌落接种于5mL含Amp的LB培养液,3