重组人hexastatin蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达及蛋白纯化

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1、中国医学科学院＆北京协和医学院硕士研究生毕业论文硕士学位论文学校代码：学号：l0023s2007415重组人Hexastatin蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达及蛋白纯化ExDressionandDurificationofsolublerecombinantEXDreSSlonancIDUrlllCatlon0IS0lUDlereC0mDlnanIHexastatininE．coli所院：姓名：指导老师：导师小组：学科专业：研究方向：完成日期：放射医学研究所温镭赵启仁张春明张春明宋娜玲赵启仁生物化学与分子生物学分子生物学2010年05月中田医学科学院&北京协和医学院硕}j研究生‘

2、}业沦义目录技术路线⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯“l摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯”3Abstr．act⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯“4前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯”5刖舌⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯”)材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．7l实验材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7

3、1．1主要实验仪器⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·71．2主要实验试剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一71．3引物⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·81．4菌株、细胞株及质粒⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·81．5主要溶液⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯102实验方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯‘142．1人Hexastatin基因的克隆和克隆载体的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·142．2表达载体pMAL-c4x．Hexastatin的构建⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

4、⋯⋯⋯232．3重组人Hexastatin蛋白的表达及纯化⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯28实验结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯34讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯43结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯47参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一48附录一：综述一新型肿瘤血管生成抑制剂Hexastatin的研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯51附录二：综述二源于Ⅳ型胶原的肿瘤血管生成抑制剂⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯59附录三：英文缩

5、略词汇表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯70北京协和医学院硕士研究生论文技术路线EC9706细胞总RNA的提取和鉴定RT-PCR扩增目的基因重组载体转化克隆宿主菌阳性克隆的筛阳性重组质粒与阳性克隆的筛目的表达扩大培养细菌、蛋白的纯化和鉴定接连的体载上Vm上V物隧RC接定连定鉴和鉴的切的粒酶粒质的质定化组体组鉴优◆一◆撇◆黼◆删◆㈣◆北京协和医学院硕上研究生论文技术路线流程示意图密嘲眦曲l①提取总删A可／M眺J—PcRhexajta±h七二====j18．HexastatinpMAL-“x-H娃as纽tlnJ@蛋白表达盲r’II@蛋自纯化可／～一油北京协和医学院硕士

6、研究生论文摘要血管发生是从已有的血管中形成新生的管道，它对于生物体内很多正常的生理过程来说是至关重要的。1971年FolkmaIl提出了著名的“肿瘤饥饿疗法”，即肿瘤的生长和转移离不开新生血管的形成，氧气从血管中扩散的最大限值是150岬，通过抑制肿瘤新生血管的形成，阻断肿瘤细胞赖以生存的氧气及营养供给，肿瘤细胞便会发生凋亡。此学说的提出为肿瘤的生物治疗提供了新的策略，寻找内源性的血管生成抑制因子成为近年来研究的热点。Hexastatin来源于细胞外基质，是IV型胶原蛋白a6链的非胶原区NCl，由229个氨基酸组成，分子量是25kD。近年来研究表明Hexastatin可以通过一种

7、RGD非依赖方式与整合素分子a。p3结合，调节内皮细胞的黏附和迁移，并且剂量依赖性地抑制内皮细胞的增殖，对新生血管的生成起到显著的抑制作用。另外，实体瘤实验证实HexaStatin还能有力地抑制肿瘤细胞的生长，它在癌组织中含量的下调可以作为肿瘤浸润的重要指标，起到提前预警的作用。本研究从人食管癌EC9706细胞中克隆出Hexastatin基因，在大肠杆菌中进行了可溶性表达，并利用麦芽糖结合蛋白(MaltoseBindingProtein，MBP)可专一性结合于直链淀粉(AmyIose)亲和树