肌钙蛋白ⅰ的可溶性表达及纯化研究

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1、肌钙蛋白Ⅰ的可溶性表达及纯化研究作者：周梅珍,蒋舒寒,曹林,胡敏进,华子春【摘要】目的：提高肌钙蛋白Ⅰ（troponinⅠ,TnⅠ）在大肠杆菌中的可溶性表达并进行分离纯化。方法和结果：将质粒CBDintein/pTWIN1和TnⅠ/pET28a分别用NcoⅠ及XhoⅠ双酶切,回收。回收后的载体CBDintein/pTWIN1与TnⅠ片段用T4连接酶连接,得到重组质粒CBDinteinTnⅠ/pTWIN1。将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达得到融合蛋白CBDinteinTnⅠ。经chitin亲和层析和intein介导的融合蛋白自我裂解,纯化得到重组Tn

2、Ⅰ。结论：通过CBDintein融合表达系统一步式裂解分离纯化能方便快捷地获得可溶性的TnⅠ。【关键词】肌钙蛋白I；表达；CBDinteinTnⅠ；chitin亲和层析肌钙蛋白Ⅰ（troponinⅠ，TnⅠ）是原肌球蛋白复合物中肌钙蛋白的组成成分之一,目前在横纹肌中主要发现了3种异构体,其中2种存在于骨骼纤维（快骨骼纤维和慢骨骼纤维）中,1种存在于心肌中。骨骼肌TnⅠ由181个氨基酸残基组成,相对分子质量为21000。TnⅠ的经典功能是作为原肌球蛋白的组成部分参与条纹肌的钙离子依赖性收缩［1］。Moses等［2］在1999年发现了快骨骼纤维中TnⅠ新的生物学功能。他们通过鸡胚尿囊膜

3、和小鼠角膜试验,揭示了TnⅠ能够抑制血管新生的功能。体外试验中,其生物活性比目前已进入临床实验的同类型血管生成抑制剂（包括endostatin和angiostatin）强10～100倍,是一种极具研究和开发价值的新型抗肿瘤药物。但是,长期以来由于重组TnⅠ在大肠杆菌中表达时易形成无生物活性的包涵体产物,因此有生物活性TnⅠ的表达和纯化一直成为TnⅠ研究和应用的瓶颈环节。采用ProgelTSKG3000WXL柱纯化重组包涵体形式的TnⅠ是目前效果最好的纯化方法,但它步骤繁琐,其中的变复性步骤对蛋白活性亦有很大影响［35］。本研究旨在寻找一种能提高TnⅠ在大肠杆菌中可溶性表达及简易便捷的

4、分离纯化方法,以促进TnⅠ进一步的功能研究和应用。1材料与方法1.1试剂、质粒与菌株大肠杆菌(E.coli)Top10、BL21(DE3)、含TnⅠ基因的pET28a质粒来自本实验室；CBD(chitinbindingdomain)intein/pTWIN1质粒和chitin介质购自NEB公司；限制性内切酶、T4连接酶等酶类购自大连TaKaRa公司；IPTG购自华美生物工程公司。1.2方法1.2.1重组质粒的构建质粒CBDintein/pTWIN1和TnⅠ/pET28a分别用NcoⅠ、XhoⅠ双酶切,回收。回收后的载体CBDintein/pTWIN1与TnⅠ片段用T4连接酶连接,

5、即得到重组质粒CBDinteinTnⅠ/pTWIN1。将重组质粒转化E.coliTop10,用含有氨苄霉素的LB平板筛选阳性克隆,挑取单克隆进行PCR鉴定,酶切。阳性克隆送上海英骏（Invitrogen）公司测序鉴定。1.2.2融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达1.2.2.1含重组质粒的大肠杆菌在3mlLB培养基中的表达将重组质粒CBDinteinTnⅠ/pTWIN1转化BL21（DE3）大肠杆菌,再将单克隆接种到3ml含氨苄霉素的LB培养基中,37℃培养过夜。过夜菌按1∶1000的比例转接到3ml的LB液体培养基中37℃摇菌培养,当A600nm达到0.8时,加入终浓度为0.5mmo

6、l·L﹣1的IPTG,37℃诱导3h。离心收获菌体,将菌体重新悬浮于300μl的PBS中,调节A600nm一致,超声破碎,12000r·min-14℃离心10min,取菌体裂解液,上清及沉淀进行SDSPAGE分析。Grabit2.5分析软件对SDSPAGE电泳图谱进行灰度扫描分析。1.2.2.2含重组质粒的大肠杆菌在500mlLB培养基中的表达将重组质粒CBDinteinTnⅠ/pTWIN1转化BL21（DE3）大肠杆菌,再将单克隆接种到500ml含氨苄霉素的LB培养基中,37℃摇菌培养。当A600nm达到0.8时,加入终浓度为0.5mmol·L-1的IPTG,25℃培养5h,

7、离心收获菌体。将表达的菌体重新悬浮于25mlB1（20mmol·L-1TrisHCl，500mmol·L-1NaCl，1mmol·L-1EDTA，pH8.5）平衡缓冲液中,超声破碎,12000r·min-14℃离心30min,取上清。1.2.3融合蛋白CBDinteinTnⅠ/pTWIN1的纯化4℃下用B1平衡缓冲液对柱床体积为5ml的chitin亲和层析柱进行平衡,然后将上清加载到chitin柱上,再用3倍柱床体积的B2缓冲