蛋白表达及纯化研究中的FAQ

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1、蛋白表达及纯化研究中的FAQGeneNews基因快讯2004年第3期蛋白农达及纯化研究屮的FAQ一、原核蛋白表达及纯化1、怎样提高E.coli屮6’Ilis标签蛋门的表达水平？6XIlis标签蛋白的表达水平低原因可能为：冃标蛋白有毒或不稳定，或者是细菌生长过程中不能维持表达结构。有时候，插入片段的5,端序列编码了十扰转录或翻译的元件(比如有反向重复序列而形成茎环结构，掩盖了Shine-Dalgarno序列)，在这种情况下，有必要检查和修改表达序列。改变培养基和宿主菌也可能会有所帮助。外源性蛋门的表达会使宿主菌生长迟缓。高速的转录、翻译重组蛋口所需要的代谢

2、消耗，导致宿主菌生长的缓慢。低浓度卜•即影响宿主菌生长的基因产物被认为'有毒'，这样的产物包括细胞膜蛋白或与DNA相互作川或干扰电了传递的蛋白。为了降低有毒蛋白在被诱导前对宿主菌生长的影响，在无诱导的时候的基础转录水平越低越好，并月•诱导前的细菌传代数要控制在最小范围。细菌生长过程屮质粒的丢失有时候可以通过在培养基小加入高浓度的ampicillin(200ug/ml)或carbonicillin(50ug/m1)得到解决。对于一些不稳定的表达结构，应当避免过夜培养起始菌。先从新鲜的培养基上挑选单克隆，少量培养后，2000倍稀释大量培养。含有疏水基团的垂组

3、蛋门往往对宿主菌有毒性。因此，除非有特殊的意义，应当去除插入片段屮编码信号肽序列或穿膜区的序列。然而，也有少数包含信号肽的蛋门可以在膜间质少量的表达。这种情况下，建议诱导前培养温度降低为25度。冇些蛋白，尤其是小于lOKDa的蛋白在E.coli中不稳定，可能很快被细菌中的蛋白酶降解。克服这种困难的方法包括：降低培养温度到30度；使川一种或多种蛋门酶缺陷的宿主菌；使用QIAGEN公司的表达质粒pQE-16、pQE-40,使生成标多肽与DHFR的融合蛋白；如果是纯化过程中蛋白易降解，则可以在纯化试剂中加入甘油以及蛋白酶抑制剂，并且确保整个操作在4度完成。2、

4、如何在E.coli中表达高度毒性的蛋白?在E.coli中表达高度毒性的蛋白往往是很困难的。毒性基因表达'泄漏'会杀死宿主菌，尤其在8期的生长或转化后，可以使含有突变的不表达质粒的细菌选择性生长。因此，要表达高毒性的蛋白，需要更高水平的lac抑制蛋白。推荐同时使用QIAGEN公司的PQE-80L系列表达载体和M15[pREP4]宿主菌行pQE-80L系列表达载体带有lac抑制了基因，宿主菌M15[pREP4]带有pREP4质粒，两者持续的正向或反向高水平表达lac抑制蛋白。这样协同作用，对以使诱导前的表达降低到最小的水平，因而提高成功农达毒性蛋白的可能性。

5、3、如何提高E.coli中可溶性蛋白的表达量？在E.coli屮表达的真核细胞蛋门往往形成不可溶的包含体。原因可能包括疏水基团的相互作用，半胱氨酸在E.coli胞质还原性环境中不能正确形成二硫键。QTAexpress纯化系统的-•个优点就在于包含体中带有6XHis标签的蛋口对以在变性剂作用下生成可溶性蛋门，然后用Ni-NTA纯化。如有必要，变性条件下纯化的蛋门可以复性，重新折叠。尽管如此，很多研究者还是发现纯化过程中的复性比较因难。另一个方法是调整表达环境使生成少最的可溶的天然构象的重组蛋门。即使形成了包含体，一些带6XHis标签的蛋白仍可以在胞质中，这些

6、胞质中的可溶性蛋白可以在天然的非变性的条件下被纯化。如果需要更多的可溶性蛋口，诱导后降低培养温度会有所帮助。培养温度常常直接影响蛋口表达水平和可溶性，降低温度可以降低表达水平从而使可溶性蛋白量增加。另外，也可以在诱导前让培养物达到更高的细胞密度而表达期控制在最短时间。IPTG的浓度可以从ImM降低到0.0005mM,使表达水平降低90%以上。并且，改变宿主菌也可能有效，因为某些菌比其它菌对某些蛋白的耐受性更好，可以生成更高浓度的可溶性蛋白。最后，很多蛋白需要金属协同凶子才能够保持其对溶状态，凶此在培养物中加入金属盐对能会有帮助。如果不知道蛋白所需的金属协

7、同因子，则冇必要测试不同的添加物。需要注意的是一些二价的阳离子会影响蛋白与Ni-NTA的结合。4、如何在使用Ni-NTA纯化蛋白过程中去除富含组氨酸的杂蛋白？在结合试剂与洗脱试剂屮加入20讪的咪哇（即使在变性条件下），可以抑制杂蛋白的结介。实验中逐步提高咪哇的浓度，以确足最佳的去除杂蛋白的浓度。过量使用Ni-NTA也会导致非特界性的结合。因此，对应于预期的表达蛋口量來确定合适的结合体系，对以减少非特异蛋白的结合。很多杂蛋门可能是由于非特异的离子作川引起的，因此纯化过程屮确保在试剂中加入至少300mM的NaCl。杂蛋白也可能与标签蛋白结合。加入b-ME（到

8、20mM）可以解离杂蛋白与6,His标签蛋白间形成的二硫键。这在冃标蛋白中包含相