蛋白质表达及纯化策略

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1、蛋白表达及纯化策略一•目录：含组氨酸标签的蛋白诱导表达及纯化GST-融合蛋白的纯白化策略DEAE纯化蛋白策略分子筛纯化蛋白策略二•试剂：所用试剂均购自上海生工三•资料来源：汪德强老师四撰写:罗淼牛司强含组氨酸标签的蛋白的诱导表达及纯化.用IPTG诱导启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因所需特殊试剂:1MIPTG1.将目的基因与IPTG诱导表达载体连接，构成重组质粒并转化相应的表达用的大肠杆菌。将转化体铺于含相应抗生素的LB平板，3丁C培养过夜。通过酶切序列分析等筛选带有插入片段的转化体。2.分别挑取对照菌和重组菌1个菌落

2、，接种于lml含有相应抗生素的LB培养液中，37°C通气培养过夜。3.取100微升过夜培养物接种于5ml含有相应抗生素的LB培养液屮（各10份），适当的温度（20—37°C）震荡培养4小时，至对数中期（A550=0.1-1.0)o1.对照菌和重组菌各取lml未经诱导的培养物于离心管中，剩余培养物中加入IPTG至终浓度分别为0.5,1.0,1.5,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0mM相同的温度继续通气培养。2.在诱导的1,2,3,4,5个小时取lml样品于Ep管屮。细菌的生长速率严重影响外源蛋白的表达，因

3、此必须对接种菌量，诱导询细菌生长时间和诱导后细菌密度进行控制。生长过度或过速会加重细菌合成系统的负担，导致包涵体的形成。牛长温度可能是影响大肠杆菌高度表达目的蛋口的最重要因素。低温培养能在一定程度上抑制包涵体的形成。IPTG的浓度对表达水平的影响也非常大。所以通过试验确定最佳的培养条件是很必要的。3.将所有样本室温最高速度离心1分钟，弃上清，沉淀重悬于100微升1XSDS蛋白上样缓冲液屮，100°C加热5分钟，室温最高速度离心1分钟，取15微升样品上样于SDS聚丙烯酰胺凝胶，用SDS-PAGE观察表达产物条带，从而确

4、定优化的培养条件。二.大量表达靶蛋白1.取保存的重组大肠杆菌菌液150微升接种于30毫升含相应抗生素的LB培养液屮，在100毫升锥形瓶中，300rpm,37°C通气过夜培养。2.取16毫升过夜培养物接种于800ml含相应抗生素的LB培养液，在2L的锥形瓶中用预实验所确定的最佳诱导温度，300rpm,通气培养4小吋，至对数生长中期。3.以预实验确定的最佳TPTG浓度，最佳时间和最佳温度诱导表达靶蛋白。4.收集菌液，4°C,5000g(5500rpm)离心15分钟收集沉淀，一70£保存。三•细菌破碎和蛋白质溶解所需特殊试

5、剂：非变性裂解液：50mMNaH2PO4,300mMNacl,10mM咪呼，pH8.0超声破碎液：50mMNaH2PO4,300mMNacl,pH&O1.每200ml菌液离心所得沉淀以10ml非变性裂解液充分重悬，同时加入蛋白酶抑制剂PMSF至终浓度ImMo2.超声破碎细菌，功率选择在稍低于溶液产生泡沫的水平。工作时间5秒，间隙吋间5秒，总吋间20分钟（破碎时间一般不宜超过10分钟,菌量不超过lg）o整个超声过程中探头离烧杯底部1厘米为佳，烧杯置于冰浴屮。3.超声破碎后，取1滴菌液于载玻片上，烤干后用结晶紫染色观察超

6、声破碎是否完全，人肠杆菌是否被破碎成球状或球杆状。破碎不完全口J适当延长超声破碎吋间。4.将细菌破碎液以lOOOOrpm,30分钟，4°C离心，收集上清。用等同于上清体积的超声破碎液重悬沉淀。5.分别取10微升上清和沉淀重悬液用于SDS-PAGE检测，以确定是包涵体表达还是上清表达。其余置于一70°C保存。四.Ni-NTA亲和纯化带组氨酸标签蛋白的纯化策略（一）若为上清表达所需特殊试剂：非变性裂解液：50mMNaH2PO4,300mMNacl,10mM咪卩坐，pH8.0Washbuffer:50mMNtH2PO4,3

7、00mMNacl,20mM咪醴，pH&OElutionbuffer:50mMNaH2PO4,300mMNacl,250mM咪哮，pH&O1.离心后上清蛋白与Ni・NTA混匀，冰水浴中于脱色摆床上轻摇1小时，使之充分混匀结合。为了完全去除杂质，离心两次或离心后用0.4微米微孔滤膜过滤。2.将混合物转移至层析柱中，让液体门然流出，速度可稍慢（5-6秒/滴，收集流出液体。可以取样进行SDS-PAGE,看蛋白挂柱情况。3.用Washbuffer洗涤层析柱，洗涤量约为胶体积的50-100倍，以便充分洗去杂蛋口。为了洗的更彻底，

8、可以把胶混悬后再让液体流出，中间可以重复数次。因为胶板结Z后，洗涤效果可能会差些。1.用Elutionbuffer洗柱，用1.5mLEP管收集洗脱液，直至A28o