zhou目的蛋白质表达、纯化、检测

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1、实验五目的基因的原核表达及检测现代分子生物学大实验实验目的重点掌握表达载体构建的原理及方法掌握目的基因原核诱导表达的原理及方法了解目的蛋白质“标签”纯化的基本原理和方法掌握PAGE变性凝胶电泳的原理及方法掌握考马斯亮蓝染色的方法实验原理目的蛋白质的诱导表达目的蛋白质的纯化目的蛋白质的检测实验原理蛋白质的表达：将克隆基因插入合适载体后导入宿主细胞表达大量蛋白质的方法。体内很难分析单个蛋白质的作用进行大量表达和纯化是为了在体外进行研究应用于蛋白纯化、定位及功能分析等方面实验原理图pET14b-His-TAT-EGFP-p38-16pep

2、tides融合蛋白在Hela细胞中的荧光显微镜检测（×400）例酵母表达系统昆虫表达系统哺乳动物细胞表达系统表达的蛋白具有正常的活性、构象技术难度较大、耗时、耗资大肠杆菌表达系统实验技术简单，时间较短，费用低，系统比较完备不能有效地对重组蛋白质进行修饰加工，易形成包涵体原核细胞表达系统真核细胞表达系统实验原理原核细胞表达系统菌株菌株内源的蛋白酶过多，可能会造成外源表达产物的不稳定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成为理想的起始表达菌株。堪称经典的BL21系列就是lon和ompT蛋白酶缺陷型，也是我们非常熟悉的表达菌株。大名鼎鼎的BL21

3、(DE3)融源菌则是添加T7聚合酶基因，为T7表达系统而设计。实验原理原核表达质粒的构建目的基因表达载体PlasmidTaglacIqPromoterAmpr多克隆位点实验原理目的基因/DNA/PCR/酶切/Primer例：p38中抑制多肽16肽序列GGAAGAACATTGTTTCCTGGTACAGACCATATTGATCAGTTGAAGCTCF5’-ACGGATCCTAGGAAGAACATTGTTTCCTGGT-3’R5’-ACGGATCCTTAGAGCTTCAACTGATCAATATGG-3’5’端引物中AC是随机保护碱基，GG

4、ATCC是BamHI酶切位点，TA是为防止移码而引入的两个碱基，随后是编码16肽前7个氨基酸的碱基序列。3’端引物中AC是随机保护碱基，GGATCC是BamHI酶切位点，TAA是终止密码子的反向互补序列，随后是从编码16肽碱基序列的最后一个碱基开始的反向互补序列。实验原理表达载体能将外源基因运载到大肠杆菌细胞中;在基本骨架的基础上增加表达元件，就构成了表达载体。元件启动子、终止子、核糖体识别序列诱导性表达所需要的元件操纵子序列调控基因多克隆位点融合Tag复制起始序列筛选标记/报告基因各种表达载体的不同之处在于其表达元件的差异。实验原

5、理启动子的强弱是对表达量有决定性影响的因素之一。从转录模式上看有组成型表达和诱导调控型表达。lac和Tac，PL和PR，T7是最常用的启动子，转录终止子核糖体结合位点启动子、终止子、核糖体识别序列操纵子序列及配套的调控基因诱导性表达所需要的元件多克隆位点复制起始序列实验原理用作分离的载体蛋白被称为标签蛋白或标签多肽（Tag）。标签位于表达载体的多克隆位点的N端或者C端，能够与目的基因融合表达（N端或者C端融合表达）。目前常用的标签有组氨酸标签（His-Tag）谷胱甘肽S转移酶（glutathioneStransferase）标签（

6、GST-Tag）硫氧还蛋白（thioredoxin,Trx）标签麦芽糖结合蛋白（MaltoseBindingProtein,MBP）蛋白质A（proteinA）纤维素结合位点（cellulosebindingdomain）标签等。一般对于小分子用较大的Tag（如GST）以获得稳定表达；而一般的基因多选择小Tag（如His）减少对目的蛋白的影响。实验原理筛选标记/报告基因表达抗药性基因，Amp是最常见的筛选标记，kana，新霉素，四环素，红霉素和氯霉素。抗性基因的选择要注意是否会对研究对象产生干扰，比如代谢研究中要留意抗性基因编码的酶

7、是否和代谢物相互作用。GFP（绿色荧光蛋白）是最常用的报告基因了，半乳糖苷酶，荧光素酶。一些融合表达Tag也有报告基因的功能。实验原理常用表达载体pGEX系列载体是谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白表达系统的载体。PtacPromoterAmppGEX-KGpET系列的载体是His6融合蛋白的表达载体。T7KanapET-14b实验原理目的蛋白质的诱导表达lacIq（Lactose）lacI是大肠杆菌中lac操纵子（Operon）的调节基因，它所表达的阻遏蛋白是lac操纵基因（Operator）的抑制因子，抑制转录启动。当有乳糖存

8、在时，这种阻遏蛋白能与过量的乳糖结合而失去对操纵基因的抑制，使lac操纵子上的结构基因lacZ（β-半乳糖苷酶)、lacY（透性酶)、lacA(乙酰基转移酶）得以正常表达，启动转录。IPTG（异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷)作为乳糖