目的蛋白表达与纯化protocol

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1、目的蛋白表达与纯化protocol小量表达测试：1、挑一单克隆到3mlLB（含抗生素）中，370C，220rpm振荡培养10h~12h。2、保种：700μl菌液+400μl80%灭菌甘油，充分混匀后置于-800C保存。3、扩大培养：以1:100接菌，即取50μl菌液到5mlLB（含抗生素）中，370C，220rpm振荡培养2h~3h至OD值达到0.6。4、对照取样：取1ml菌液，12000rpm离心1min，弃尽上清，-200C保存。对照5、另取1ml菌液于一新的试管中，加1/1000IPTG（终浓度为1mM），37

2、0C，220rpm振荡培养3h后收菌：12000rpm离心1min，弃尽上清，-200C保存。370C样品6、其余约3ml菌液于160C，220rpm继续振荡培养1h后，加0.5/1000IPTG（终浓度为0.5mM），160C，220rpm振荡培养12~24h（通常18h）后收菌：12000rpm离心1min，弃尽上清，-200C保存。160C样品7、Bugbuster分别处理上述三个样品，取20μl总蛋白，其余离心后分离上清和沉淀，进行SDS-PAGE电泳鉴定，上样顺序为：对照370C样品160C样品总蛋白上清沉

3、淀总蛋白上清沉淀总蛋白上清沉淀若目的蛋白在上清中有表达，则可以进行大量表达与纯化，具体操作如下。大量表达：1、挑一单克隆到7.5mlLB（含抗生素）中，370C，220rpm振荡培养10h~12h。注意：此步用50ml离心管摇菌！2、扩大培养：以1:100接菌，即取将上述7.5ml菌液全部接到750mlTB（含抗生素）中，370C，220rpm振荡培养4h~5h至OD值达到1.0。3、对照取样：取1ml菌液，12000rpm离心1min，弃尽上清，-200C保存。（对照）4、其余约菌液于160C，220rpm继续振荡

4、培养1h后，加0.5/1000IPTG（终浓度为0.5mM），160C，220rpm振荡培养12~24h（通常18h）后收菌：6000rpm、40C离心10min，弃尽上清，取一点沉淀做表达鉴定（160C样品），其余-200C保存。1、Bugbuster分别处理上述两个样品，进行SDS-PAGE电泳鉴定。（同小量表达中的7）菌体破碎（高压破菌法）：1、若目的蛋白在上清中有表达，则可取剩余菌体Ng(根据目的蛋白的表达量而定)，用4-6×Nml的lysisbuffer将菌体重悬，加入0.1mM的PMSF，置于50/100

5、ml小烧杯中，并将烧杯置于冰上。2、用超声破碎仪进行破碎，功率一般为100W~200W，超声时间为3s，间隙时间为5s，工作次数一般为99×4次。3、将破碎后的菌液移入50mlBECKMAN高速离心管中，18000rpm、40C离心30-40min，将上清移入一个新的50ml离心管中。Ni柱亲和层析：Lysisbuffer:50mMTris,300mMNaCl,pH8.0（可加入5-10%的甘油和1mMdTT，20mM咪唑）Washbuffer:50mMTris,300mMNaCl,20mM咪唑,pH8.0Eluti

6、onbuffer:50mMTris,300mMNaCl,500mM咪唑,pH8.01、取适量的beads灌入玻璃柱中，用大量的ddH2O冲洗beads，一般为10CV×5（CV代表柱体积，下同）。2、用lysisbuffer进行平衡：10CV×5。3、将平衡好的beads移入菌体破碎最后得到的上清中，Mix1~2h。4、500g，40C离心2min，收集上清——flow-through。5、加入50mlwashbuffer，500g，40C离心2min，收集上清——wash1。6、加入50mlwashbuffer，5

7、00g，40C离心2min，收集上清——wash2。7、加入50mlwashbuffer，500g，40C离心2min，收集上清——wash3。8、将beads灌入玻璃柱中，继续用washbuffer洗10CV×3。9、用Elutionbuffer洗脱：0.5CV×10，用EP管分别收集eluates。10、SDS-PAGE电泳鉴定。Resinregeneration:1、用0.1MEDTA洗2CV（清洗至beads为无色）。2、ddH2O洗5CV。1、0.1MNaOH洗2CV。2、ddH2O洗5CV。3、加2CV的

8、NiCl2。4、ddH2O洗5CV。5、用20%乙醇洗2次beads，置于4~80C保存。GST柱亲和层析：Lysisbuffer:1×PBS(140mMNaCl,2.7mMKCl,10mMNa2HPO4,1.8mMKH2PO4,pH7.3)Washbuffer:1×PBSElutionbuffer:50mMTris,10mMreducedgl