Fit-1胞外Ⅲ区蛋白的可溶性表达、纯化及活性测定

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1、生物工程学报ChinJBiotech2009，April25；25(4)：580-586journals．im．ac．crlChineseJournalofBiotechnologyISSN1000-3061cjb@irn．ac．on@2009InstituteofMicrobiology,CAS&CSM,AllrightsresewedFit．1胞外Ⅲ区蛋白的可溶性表达、纯化及活性测定谢印良，谷岳，黄蕊，李雪霞，杜雪，王金宏，熊冬生，杨纯正，许元富1中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所血液病医院实验血液学国家重点实验室，天津3000202天津医科大学总医院，天津300020

2、摘要：本研究旨在克隆和表达人血管内皮生长因子受体一1胞外III区蛋白，并测定其生物学活性。应用RT-PCR法从人脐静脉内皮细胞中克隆f．1胞外III区基因片段，经测序鉴定后再克隆到原核表达载体pAYZ中，构建出的表达载体pAYZflt一1HI转化大肠杆菌16C9后，用低磷培养基诱导表达目的蛋白；采用E．tag亲和层析柱纯化目的蛋白；用SDS—PAGE、Westernblotting和BCA法对其进行定性、定量检测鉴定；用ELISA、损伤愈合试验和Transwell法检测靶蛋白生物学活性。克隆的f一1胞外III区基因经测序鉴定正确。所构建的pAflt一1III表达载体经低磷培养基诱

3、导后高表达出可溶性Fit一1胞外IⅡ区蛋白，产量约为1．1mg／L；ELISA结果显示该蛋白可以结合VEGFl65，并表现为剂量依赖性，其与配体结合的解离常数为1．180pmol／L。损伤愈合试验和Transwell结果显示该蛋白可以抑制VEGF165(50ng／m1)和bFGF(100ng／mL)诱导的脐静脉内皮细胞的迁移，并呈剂量依赖性。这将为今后开展人fit一1基因III区的功能研究及其单抗研制奠定了实验基础。关键词：血管内皮生长因子受体1，血管新生，血管内皮生长因子165Solubleexpressilon，pPurifiticationandi1acztuiviltya

4、nahlys"tsot“extracellulardomainIIIofFltlYinliangXiel，YueGu，RuiHuang，XuexiaLi，XueDu，JinhongWang，DongshengXiong，ChunzhengYang，andYuanfuXu1TheStateKeyLaboratoryofExperimentalHematology，InstituteofHematology，ChineseAcademyofMedicalSciences＆PekingUnionMeScalCollege，Tianjin300020，China2TianjinMedic

5、alfniversityGeneralHospital，Tianjin300020，ChinaAbstract：ToprepareasolublehumanextracellularIIIdomainofF1tlandanalyzeitsbiologicalactivity．ThegeneencodingextracellulardomainIIIofFit一1wasclonedintotheexpressionvectorpAZYbvRT-PCRfromhumanumbilicalveinendothelialcell(HUVEC)，andinducedtoexpressinE

6、scherichiacolibylowphosphoricmedium，theproductwaspurifiedbyE·tagaffmitychromatography．SDS—PAGEandWesternblottinganalysisshowedthatFit一1genedomainIIIgenewasexpressedinEcoliandtheyieldofthesolublefusionproteinwasabout1．10mg／L．Enzyme—LinkedImmunoSorbentAssay(ELISArevealedthattheFit—ldomain111was

7、abletobindtoVEGF165dose—dependently．MonolayerdenudationassayandTranswellassayshowedthatthefusionproteincouldinhibitHUVECsmigrationinducedbyconditionalmediumwith50ng／mLVEGF]65and100ng／mLbFGF．IIlconclusion，Fit一1genedomainIIIgenehasbeensuccessfu