bdnftat融合蛋白在大肠杆菌中的表达纯化及体外活性测定

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1、优秀毕业论文南方医科大学硕士学位论文BDNF-TAT融合蛋白在大肠杆菌中的表达纯化及体外活性测定姓名：罗道飞申请学位级别：硕士专业：药剂学指导教师：季爱民20110527精品参考文献资料优秀毕业论文硕士学位论文BDNF．TAT融合蛋白在大肠杆菌中的表达纯化及体外活性测定硕士研究生：罗道飞指导教师：季爱民教授摘要神经退行性疾病，如老年性痴呆(Alzheimer'sdiseaseAD)、帕金森氏症(Parkinson’sdiseasePD)、萎缩性侧索硬化(Amyotrophiclateralsclerosis，A

2、LS)、和亨廷顿氏病(Huntington’sdiseaseHD)等，临床表现为肢体运动和学习记忆等功能障碍，主要原因是神经元功能的缺失或死亡。目前没有理想的治疗手段，在我国AD和PD这两种疾病已经累及大约1000万人给个人家庭和社会带来沉重负担【l】。研究表明，神经营养因子家族成员(neurotrophicfactors，NTFs)等，显示了很好的中枢神经系统神经退行性疾病的治疗前景【2l。脑源性神经营养因子(BDNF)是神经营养因子家族成员包括之一，与其特异性受体酪氨酸激酶家族成员trkB结合，激活下游的信

3、号传导途径，而发挥神经营养生物活性p】。然而，血脑屏障(BBB)阻碍了大分子药物从JllL液中进入大脑发挥生理作用，人大脑血脑屏障(BBB)由血管内皮细胞紧密连接组成，BBB腔内面为血液，腔外面多为外膜细胞，星行细胞及少量的神经元。天然BDNF不能透过BBB进入大脑发挥神经营养活性f51。蛋白质转导结构域(proteintransductiondomain。PTD)，如来源于人类I型免疫缺陷病毒的转录激活蛋白(Tram．activatortranscription，TAT)的PTI)，是一类富含正电荷能够将与其

4、物理或化学连接的化合物、蛋白质、或核酸类分子，带过细胞膜进入细胞浆，胞核内，甚至BBB，发挥各自的生物学功能的结构域。精品参考文献资料优秀毕业论文摘要PTD／TAT介导的蛋白质可穿过由脑血管内皮细胞组成的BBB，使所携带蛋白进入大脑发挥生理作用，而使一些在正常情况下是不能通过BBB的蛋白进入脑组细：，／、o本实验中心前期通过基因工程的方法成功制备了编码成熟BDNF—TAT融合蛋白的基因，目的在于在世界上首先制备一种能通过BBB进入中枢神经系统，治疗神经退行性疾病的基因重组神经营养因子药物制剂。基于前期研究，本文

5、采用重组质粒PET-30(a)．BDNF．TAT转化至大肠杆菌BL21(DE3)plysS中优化表达，经阳离子交换树脂优化纯化及精氨酸倍比稀释法复性BDNF．TAT融合蛋白，尾静脉给药KM种小鼠后研究其脑靶向性及其在脑组织中的分布，体外培养SD大鼠新生一周鼠背根神经节神经元检测BDNF．TAT融合蛋白的生物学活性，为进一步研究可透过血脑屏障药物BDNF．TAT融合蛋白治疗神经退行性疾病提供物质基础。目的1．研究重组质粒PET-30(a)-BDNF-TAT转化至大肠杆菌BL2l(DE3)plysS后BDNF．TA

6、T融合蛋白的表达，并优化BDNF．TAT融合蛋白在大肠杆菌中表达及纯化的条件；2．小鼠经尾静脉血管给予复性后BDNF．TAT融合蛋白，探讨其在小鼠脑组织中的脑靶向性及在小鼠脑组织【}I的分布；3．体外培养新生大鼠背根神经节神经元细胞，进一步研究复性后BDNF．TAT融合蛋白体外促进神经元存活生长的活性。方法1．根据前期课题组经基因工程办法制备的重组质粒PET-30(a)．BDNF．TAT及，本文将该重组质粒转化至大肠杆菌BL2l(DE3)plysS，37"C，1．0mMIPTG诱导4h后低温离心(4℃，5000

7、rpm)收集菌体，超声裂解，高速离心后收集各步骤样品，通过15％SDS．PAGE和WesternBlot分析确定融合蛋白BDNF．TAT在大肠杆菌中的表达形式；分别选取25"C、30"12、33"C、37‘C、40"C为不同的Ⅱ精品参考文献资料优秀毕业论文硕士学位论文诱导温度，对诱导温度进行优化；分别选取0．1mM、0．5mM、1．0mM、1．SmM为IPTG诱导浓度，对IPTG诱导浓度经行优化；选取l、2、4、6、8为诱导时间，对诱导时间经行优化；收集各条件下大肠杆菌并经行15％SDS．PAGE和Wester

8、nBlot分析确定BDNF．TAT融合蛋白在大肠杆菌中的最佳表达条件。2．重组质粒转化至大肠杆菌后，经25℃，0．5mMIPTG诱导4h后离心收集湿菌体，PBS重悬洗涤后用60％强度超声破碎仪裂解大肠杆菌，4"C、12000rpm低温高速高速离心去上清，沉淀用2M尿素和0．4％DOC洗涤并重复洗涤一次，低温高速离心去上清，包涵体沉淀用8M尿素4。C搅拌溶解14h，溶解后蛋白通过中高压层