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《地衣芽孢杆菌胞外蛋白酶的纯化及特性分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、第30卷第3期水生生物学报Vol.30,No.32006年5月ACTAHYDROBIOLOGICASINICAMay,2006地衣芽孢杆菌胞外蛋白酶的纯化及特性分析1,2121曹煜成 李卓佳 吴灶和 冯 娟(11中国水产科学研究院南海水产研究所, 广州 510300;21湛江海洋大学水产学院, 湛江 524000)摘要:研究不同条件对地衣芽孢杆菌De株产生胞外蛋白酶的量及其酶活性的影响,结果表明在pH为714—812范围内,温度为30℃时,培养8—12h的菌株所分泌胞外产物中的蛋白酶活性最高。实验先以半透膜
2、法收集芽孢杆菌的胞外产物,然后再经过硫酸铵沉淀过夜、SephadexG2100凝胶层析和DEAE2Cellulose离子交换层析及聚丙烯酰胺凝胶电泳等四个步骤的分离纯化后,可以得到含有3种主要蛋白质(BLP1、BLP2、BLP3)成分的胞外蛋白酶,其分子量分别为6612KD、3110KD及约2011KD,所得纯化蛋白酶的蛋白浓度为01773μg/mL,蛋白回收率为11166%。实验还发现,纯化的胞外蛋白酶在100℃下作用30min,仍可保持其活力,可见具有相当的热稳定性,而其酶活最佳的pH和温度条件分别为7
3、18和45—65℃。酶活抑制实验显示EDTA、铜、钴、镁离子等均可成为其酶活抑制因子;而丝氨酸蛋白酶抑制剂甲基磺酰氟(PMSF)、铁、锰、钡、钙离子等对酶活性没有明显影响;锌则会令之酶活性其部分丧失。关键词:地衣芽孢杆菌;胞外产物;纯化;特性分析中图分类号:Q936文献标识码:A文章编号:100023207(2006)0320262207 近年来,地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)作纯化到理化特性均都进行了系统地分析,为地衣芽为一种微生态制剂广泛应用于水产养殖业中,它和孢杆菌胞外产
4、物在水产上的应用提供一定的理论参其他种类的芽孢杆菌、光合细菌等有益微生物共同考。作用,可有效地改善养殖水体的生态环境,并促进养1 材料与方法[1,2]殖生物的生长和发育。李卓佳等人研究了芽孢杆菌制剂对对虾养殖水体中的细菌、浮游藻类、浮游111 菌种 地衣芽孢杆菌De株是由中国水产科学动物及其他一些环境因子如生物好氧量、化学好氧研究院南海水产研究所健康养殖中心分离保存菌量、硫化物和氨氮浓度水平等的影响,科学地评价了株。其形态呈杆状,规格为116—218μm×016—芽孢杆菌制剂对养殖生态环境的改良作用。地衣芽
5、018μm,格兰氏染色为阳性,在营养琼脂培养基上菌孢杆菌的胞外产物具有很强的蛋白酶[3]、脂肪酶[4]、落不透明,表面粗糙,边缘呈毛发状。能分泌一定量淀粉酶[5]活性,国内外也有不少对其胞外酶研究的的胞外酶物质。相关报道。Sogarrd报道[6],地衣芽孢杆菌有较强的112 细菌的培养 将De接种于营养琼脂斜面上,32℃下培养12h,用经高压灭菌的生理盐水制备菌胞外酶活性,可降解某些复杂的植物性碳水化合物8悬液(浓度为218×10CFU/mL)。用无菌涂布棒将如果胶、羧甲基纤维素、多聚半乳糖醛酸等。吴铁[7
6、]015mL的菌悬液涂布于表面覆盖有玻璃纸的营养琼林等用地衣芽孢杆菌20386株研制成“整肠生”,脂培养基上,32℃下培养12h,即可用于提取胞外产经实践证明它能调节肠道菌群和治疗一些肠道疾物了。病。但就地衣芽孢杆菌的胞外产物在水产应用方面113 胞外产物蛋白质含量测定 将牛血清白蛋白的研究则尚未见有报道,本文对分离自对虾养殖水[8](Amresco)作为标准蛋白,以Bradford方法测得胞体中的地衣芽孢杆菌De株所产生的胞外蛋白酶外蛋白酶的蛋白质含量。(Extracellularprotease,ECP
7、ase)进行研究,从它的提取收稿日期:2005201207修订日期:2005205220基金项目:广东省重大科技专项(A3050304)资助作者简介:曹煜成(1979—),男,硕士,研究方向为微生态制剂的作用机理通讯作者:李卓佳,E2mail:jkyz609@hotmail.com3期曹煜成等:地方芽孢杆菌胞外蛋白酶的纯化及特性分析263114 消化平板法检测胞外产物的酶活性 分别配ECPase洗下来,然后在4℃下10000r/min离心30min。制含有淀粉(012%)、卵黄(10%)、脱脂牛奶(3%)、
8、上清液用0122μm的纤维素酯滤膜过滤除菌,即可得[11]1明胶(014%)等琼脂平板。其中淀粉营养琼脂培养到粗提的ECPase基的成分为:牛肉膏、蛋白胨、可溶性淀粉及琼脂粉;118ECPase的纯化 用SephadexG2100凝胶层析,卵黄营养琼脂培养基的成分为:卵黄液、蛋白胨、牛将初步收集到的ECPase加入层析柱中(110×40cm)肉膏及琼脂粉;脱脂奶琼脂培养基的成分为:脱脂奶用Tris-HCl缓冲液(
