人era蛋白在大肠杆菌中的高效表达及其纯化

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1、人Era蛋白在大肠杆菌中的高效表达及其纯化作者：吴元明，陈苏民，陈南春，纪宗玲，刘惠萍，张俊杰【关键词】人Era基因　　关键词:人Era基因;基因表达;蛋白纯化　　摘要:目的在大肠杆菌中对人的era基因（简称hera）进行表达、纯化.方法PCR扩增hera基因，测序正确后克隆入大肠杆菌融合表达载体pRSET-C，重组质粒pRSETC-hera以大肠杆菌BL21（DE3）为宿主菌，用IPTG进行诱导表达.然后利用亲和层析的方法对表达蛋白进行纯化.结果克隆了hera基因，测序正确;利用pRSET-C载体在大肠杆菌中融合表达了全长hera-cDNA基因，表达量占细菌总蛋白的59.6%.融合

2、蛋白在菌体内主要以包涵体形式存在，在变性条件下用Ni-NTA亲和色谱柱纯化此融合蛋白，其纯度达到了98.0%.结论利用基因重组技术在大肠杆菌中高表达了hera基因.并对融合蛋白进行了初步纯化.　　　KeyanEragene;geneexpression;protEinpurifi-cation　　Abstract:AIMToexpresshumanEraprotEIninE.coliandpurifyitpreliminarily.METHODSAfterbeingamplifiedbyPCRandidentifiedbysequencingthehumanerageneidpRSE

3、TC-heraedintoBL21（DE3）and　inducedotography.RESULTSThehumanerageneplifiedandthesequenceprovedtobecorrect.Thehera-cDNAgenehadbeenclonedintothevectorandex-pressedinE.coli，andtheexpressedproteintook59.6%ofthetotalbacterialprotein.Thefusedproteinexistedinthepatternofinclusionbody，anditotographycolum

4、n.CONCLUSIONTheheragenecouldbeexpressedinarily.　　0引言　　era基因是1986年在测定大肠杆菌基因组序列时，在编码RNaseIII的rnc基因下游发现的一个开放读框，因其编码的氨基酸序列与人及酵母的Ras蛋白有部分相似之处，命名为E.coliRas-like（era）基因［1］.era基因在原核生物中普遍存在，在真核生物如蠕虫、小鼠、人、植物中也存在与细菌era高度同源的基因.Era蛋白是小G蛋白家族的新成员.它由两个结构域组成:N端是一个典型的GTPase结构域;C端结构域为Era所特有，其中含有一个KH结构域［2］.在大肠杆菌中e

5、ra基因和rnc基因同属于rnc操纵元，rnc基因和era基因的表达共同受RNaseIII的负调控［3］.era是大肠杆菌中可以正常表达的基因，但表达水平极低.遗传学实验证实era基因与细胞周期和细胞分裂有关，是细菌生存繁殖所必需的重要基因［4］.高表达的细菌Era蛋白有GTP结合及GTPase活性［5］.最近发现细菌Era蛋白可以特异地与16S-rRNA结合［6］.　　本室陈苏民教授通过计算机寻索，发现从线虫、小鼠到人都有与细菌era同源的EST序列，并且相继克隆了人及小鼠全长的era-cDNA基因.人era-cDNA基因全长约2.2kb，含长度为1038bp的开放读框，编码346

6、氨基酸的蛋白质［7］.人Era（hEra）与大肠杆菌Era（eEra）蛋白全序列比较，有31.0%相同、53.0%相似.同样，hEra也是由N端的GTPase结构域和C端KH结构域所构成［8］.新近克隆的人及小鼠era基因为整个era基因家族的功能研究提供了重要的资料.本研究目的是将hera基因在大肠杆菌中进行高表达、纯化.这为进一步研究hEra蛋白的功能打下了良好的基础.　　1材料和方法　　1.1材料　　大肠杆菌BL21（DE3）菌种购自Promega公司.pUC19质粒均为本教研室保存;表达质粒pRSET-C为Invitrogen公司产品.pBS-hera为陈苏民教授提供.各种限

7、制性内切酶、连接酶、核酸修饰酶及Taq酶均为Gibco公司产品.DNAmarker和蛋白marker为Takara公司产品.柱式质粒纯化试剂盒为华舜公司产品.NucleoTrapGelExtraction试剂盒购于CLONTECH公司.Ni-NTAspinkit为QIAGEN公司产品.　　1.2方法　　1.2.1PCR反应及产物的鉴定　　PCR引物:正向:5'-AAGGATCCAACAGAGATGAGCAGG，反向:5'-AA-CTGCAGTTATCACT