cggbp1蛋白在大肠杆菌中的表达及其纯化

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1、CGGBP1蛋白在大肠杆菌中的表达及其纯化【关键词】CGGBP1；基因表达；纯化　　0引言脆性X综合征是一种最常见的遗传性智力发育不全综合征，有超过99%的FXS是由脆性X智障基因1中5′端非编码区CGG三核苷酸重复序列不稳定扩增及其CpG岛异常甲基化导致.FMR1基因的表达产物FMRP的缺乏导致FXS的发生［1-2］.本实验对编码基因存在于3号染色体［3］，能与FMR1基因5′dn3′重复序列特异性结合的蛋白CGGBP1进行原核表达，并对其DNA结合活性进行研究.1材料和方法材料大肠杆菌DH5α,BL21

2、和表达载体pRSETA均为本实验室保存.质粒提取试剂盒购自Sigma公司；限制性内切酶BamHI和KpnI购自宝生物工程公司；T4DNA连接酶购自Promega公司；Ni2+NTA金属螯合蛋白质纯化系统购自Qiagen公司；链酶亲和素磁珠购自Dynal公司；低分子质量蛋白标准购自上海西巴斯生物技术有限公司.　　方法8/8　　表达载体的构建根据CGGBP1基因起始密码子和终止子邻近序列设计PCR引物：CGGBP1FCGCGGATCCGAGCGATTGTAGTAACAGCA，CGGBP1RGGGGTACCTCAA

3、CAATCTTGTGAGTTGAG.其上游及下游引物分别加入BamHI和KpnI酶切识别位点序列.PCR反应以人淋巴细胞cDNA文库为模板，扩增编码CGGBP1的基因序列.设计PCR扩增体系25μL，灭菌去离子水10μL，10×反应缓冲液μL，25mmol/LMgCl2μL，DMSOμL，4×dNTP混合物2μL，CGGBP1F和CGGBP1R各10pmol，模板μL，TaqDNA聚合酶μL.扩增条件：95℃预变性5min，再94℃30s，53℃1min，72℃1min循环40次，最后72℃终末延伸产物10mi

4、n.PCR产物经琼脂糖电泳分离，用胶回试剂盒回收目的基因.用BamHI和KpnI酶切PCR产物和pRSETA，酶切产物电泳后回收，在Ｔ4连接酶作用下，目的片段定向克隆至pRSETA的BamHI和KpnI克隆位点.将重组质粒转入大肠杆菌DH5α，接种到含氨苄青霉素的LB培养基平板并挑取单菌落.融合蛋白的诱导表达将测序正确的重组质粒转入BL21.挑取携带目标质粒的单菌落接种于含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养12h，按108/8mL/L比例转接于新鲜培养基，37℃振荡培养至对数生长期时，加入I

5、PTG至终浓度1mmol/L，32℃诱导振荡培养4h，离心收集菌体，SDSPAGE分析重组蛋白的表达.蛋白表达形式的分析取5mL菌液离心，用500μL的裂解液重悬，加溶菌酶至终浓度为1mg/mL，冰浴30min，超声波裂菌，离心后分别将上清和沉淀进行SDSPAGE分析.融合蛋白的纯化将1mL500mL/LNi2+NTA悬液和4mL细菌裂解上清液轻轻混匀4℃放置60min，直接过柱.过柱结束后，用4mL漂洗液，洗脱未和Ni珠结合的杂蛋白.经过2次漂洗后再用mL洗脱液3次洗脱特异结合的目的蛋白，分步收集.取收

6、集液，进行SDSPAGE分析.与29重复序列双链DNA结合实验取10μL磁珠用1mL的无RNA酶的三蒸水清洗磁珠2次，除去防腐剂.1×生物素亲和素结合缓冲液15μL重悬磁珠，各5μL分3组实验.其中一组加入25μL生物素化的29重复序列双链DNA，另外两组分别加入25μL非生物素化的29重复序列双链DNA和25μL三蒸水做对照；三组分别再加入2×生物素亲和素结合缓冲液30μL，25℃轻摇1h.经磁力吸附后，弃上清.重复上述步骤3次；加入纯化后CGGBP115μL和2×核酸蛋白结合缓冲液208/8μL，室温下静

7、置30min；经磁力吸附后，弃上清；用1×核酸蛋白结合缓冲液清洗磁珠2次；加三蒸水10μL，沸水煮10min，进行SDSPAGE分析.　2结果原核表达载体的构建及鉴定扩增产物在15g/L的琼脂糖凝胶电泳，可观察到一条约504bp的条带；重组质粒pRSETA/CGGBP1及质粒pRSETA分别用BamHI和KpnI酶切，pRSETA/CGGBP1分为两个片段，分别为ku和504bp，均与预计结果相同.的表达用BamHI和KpnI双酶切pRSETA/CGGBP1表达质粒，筛选阳性重组质粒.携带有pRSETA/CG

8、GBP1质粒的BL21菌株，经IPTG诱导后，在Mr约25000处出现1条表达条带；而未经IPTG诱导的菌体则无此条带.诱导后的菌体经溶菌酶及超声波裂解，离心后分为上清和沉淀两部分.经SDSPAGE分析表明，CGGBP1部分存在于细菌裂解液的上清中，为可溶性蛋白，上清液中的目标蛋白相对较少.　　蛋白纯化在表达质粒pRSETA多克隆酶切位点的上游，8/8插入有连续6个组氨酸的序列—6t