cggbp1蛋白在大肠杆菌中的表达及其纯化的论文

《cggbp1蛋白在大肠杆菌中的表达及其纯化的论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、CGGBP1蛋白在大肠杆菌中的表达及其纯化的论文cggbp1蛋白在大肠杆菌中的表达及其纯化【关键词】cggbp1；基因表达；纯化　　0引言　　脆性x综合征（fragilexsyndrome,fxs）是一种最常见的遗传性智力发育不全综合征，有超过99%的fxs是由脆性x智障基因1（fragilexmentalretardation,fmr1）中5′端非编码区cgg三核苷酸重复序列不稳定扩增及其cpg岛异常甲基化导致.fmr1基因的表达产物fmrp的缺乏导致fxs的发生［1-2］.本实验对编码基因存在于3号染色体［3

2、］，能与fmr1基因5′d(cgg)n3′重复序列特异性结合的蛋白cggbp1进行原核表达，并对其dna结合活性进行研究.　　1材料和方法　　1.1材料　　大肠杆菌dh5α,bl21（de3）和表达载体prseta均为本实验室保存.质粒提取试剂盒购自sigma公司；限制性内切酶bamhi和kpni购自宝生物工程公司；t4dna连接酶购自promega公司；ni2+nta金属螯合蛋白质纯化系统购自qiagen公司；链酶亲和素磁珠购自dynal公司；低分子质量蛋白标准购自上海西巴斯生物技术有限公司.　　1.2方

3、法　　1.2.1表达载体的构建　　根据cggbp1基因起始密码子和终止子邻近序列设计pcr引物：cggbp1fcgcggatccgagcgattgtagtaacagca，cggbp1rggggtacctcaacaatcttgtgagttgag.其上游及下游引物分别加入bamhi和kpni酶切识别位点序列(引物序列下划线部分).pcr反应以人淋巴细胞cdna文库为模板，扩增编码cggbp1的基因序列.设计pcr扩增体系25μl，灭菌去离子水10μl，10×反应缓冲液2.5μl，25mmol/lmgcl22.0μl，

4、dmso2.5μl，4×dntp混合物（每种2.5mmol/l）2μl，cggbp1f和cggbp1r各10pmol，模板3.5μl（50ng/μl），taqdna（5μ/μl）聚合酶0.5μl.扩增条件：95℃预变性5min，再94℃30s，53℃1min，72℃1min循环40次，最后72℃终末延伸产物10min.pcr产物经琼脂糖电泳分离，用胶回试剂盒回收目的基因.用bamhi和kpni酶切pcr产物和prseta，酶切产物电泳后回收，在ｔ4连接酶作用下，目的片段定向克隆至prseta的bamhi和kpni

5、克隆位点.将重组质粒转入大肠杆菌dh5α，接种到含氨苄青霉素的lb培养基平板并挑取单菌落.　　1.2.2融合蛋白的诱导表达　　将测序正确的重组质粒转入bl21（de3）.挑取携带目标质粒的单菌落接种于含100mg/l氨苄青霉素的lb培养基中，37℃振荡培养12h，按10ml/l比例转接于新鲜培养基，37℃振荡培养至对数生长期时，加入iptg至终浓度1mmol/l，32℃诱导振荡培养4h，离心收集菌体，sdspage分析重组蛋白的表达.　　1.2.3蛋白表达形式的分析　　取5ml菌液离心，用500μl的裂解液（1

6、0mmol/l咪唑，300mmol/lnacl及50mmol/l磷酸二氢钠ph8.0）重悬，加溶菌酶至终浓度为1mg/ml，冰浴30min，超声波裂菌，离心后分别将上清和沉淀进行sdspage分析.　　1.2.4融合蛋白的纯化　　将1ml500ml/lni2+nta悬液和4ml细菌裂解上清液轻轻混匀4℃放置60min，直接过柱.过柱结束后，用4ml漂洗液（20mmol/l咪唑，300mmol/lnacl及50mmol/l磷酸二氢钠ph8.0），洗脱未和ni珠结合的杂蛋白.经过2次漂洗后再用0.5ml洗脱液(2

7、50mmol/l咪唑，300mmol/lnacl及50mmol/l磷酸二氢钠ph8.0)3次洗脱特异结合的目的蛋白，分步收集.取收集液，进行sdspage分析.　　1.2.5cggbp1与（cgg）29重复序列双链dna结合　　实验取10μl磁珠用1ml的无rna酶的三蒸水清洗磁珠2次，除去防腐剂.1×生物素亲和素结合缓冲液（10mmol/ltrishcl，2mol/lnacl，1mmol/ledta，1g/ltl）15μl和2×核酸蛋白结合缓冲液（20mmol/lhepes，100mmol/lnacl，0.

8、5mmol/ldtt，100g/l甘油）20μl，室温下静置30min；经磁力吸附后，弃上清；用1×核酸蛋白结合缓冲液清洗磁珠2次；加三蒸水10μl，沸水煮10min，进行sdspage分析.　　2结果　　2.1原核表达载体的构建及鉴定　　扩增产物在15g/l的琼脂糖凝胶电泳，可观察到一条约504bp的条带（图1）；重组质粒prseta/cggbp1及质粒prseta分