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1、人NDRG1的GST融合表达、纯化及相互作用蛋白检测论文杨谦，张景，张莹莹，何鹏，刘新平，药立波，赵慧贤【关键词】谷胱甘肽琼脂糖GSTfusionexpressionandpurificationofhumanNDRG1【Abstract】AIM:TobetterunderstandthefunctionofNDRG1andlookfortheinteractproteinthroughpulldotheconstructedvectorNDRG1pPROEXHTbandtransfereditintoanothervectorpGEX4T
2、1.AftergeneedintoE.coilDH5αandthestrainshighlyexpressingsolubleGSTNDRG1inLBmediumcontainingampicillinycdoregulatedgenefamily）是近几年发现的一系列和信号转导相关的分子.它包括NDRG1NDRG4，其中NDRG4又分三个亚型：NDRG4B,NDRG4B(var)和NDRG4H.而NDRG1是Kokame等1996年在研究高同型半胱氨酸血症引起动脉粥样硬化的机制时，在培养的人脐静脉内皮细胞中发现的一种由同型半胱氨酸诱导产生
3、的产物，经证实为一个含有394个氨基酸，大小为Mr47000的蛋白，当时被命名为还原剂衣酶孝反应蛋白(RTP)，随后又有不同实验室也相继克隆到编码RTP的基因，并且赋予了它多个名字［1］.NDRG1在结肠癌细胞系中高表达，因而被视为是与细胞分化程度呈正相关的抑癌基因.但新近报道，NDRG1不仅与肿瘤细胞的分化有关，也与动脉粥样硬化、血栓形成、组织缺氧有关，同时还参与应激反应，可被多种诱导剂诱导等［2］，所以检测NDRG1相互作用的蛋白会为其功能研究提供明确线索.1材料和方法1.1材料质粒提取和胶回收试剂盒购自北京天为时代公司；低分子量蛋白(
4、marker)购自上海生化试剂公司；BamHⅠ,EcoRⅠ,IPTG购自大连宝生生物公司；proteaseinhibitorcocktail购自Roche公司；质粒pGEX4T1,DH5α细胞株由第四军医大学生物化学与分子生物学教研室提供,NGDRG1pPROEXHTb由第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室张景赠送；还原谷胱甘肽购自华美生物公司；谷胱甘肽琼脂糖珠购自CLONTECH公司；SF,pH7.4），吹悬并于-70℃冻存.反复冻融3次菌体，然后超声裂菌（输出频率60Hz，每次8s,10min，冰上），离心（12kg/min,.
5、freelin）,分别取适量上清液和沉淀进行SDSPAGE电泳［3］，检验NDRG1pGEX4T1可溶性.1.2.3融合蛋白的纯化取上清20mL，加入1mL谷胱甘肽琼脂糖珠(50%)，4℃，孵育30mins,离心，沉淀用1mL含1mmol/LPMSF的1×PBS混悬，存于4℃，取适量进行SDSPAGE分析，并以NDRG1单抗为一抗，兔抗鼠为二抗进行r6.6×104左右出现新的蛋白条带.除去GST标签(Mr2.6×104),得到的相对Mr与NDRG1理论相对Mr基本相等，表明NDRG1可以在含氨苄的LB中表达.将诱导表达的细菌沉淀重悬于缓冲液
6、，并用冻融和超声裂解，取适量上清液、沉淀，进行SDSPAGE分析，在Mr6.6×104处均有明显条带（Fig2）.表达的融合蛋白经谷胱甘肽琼脂糖珠孵育纯化，并进行r6.6×104左右出现两条带(Fig3A).用NDRG1单抗为一抗，鼠抗兔为二抗，进行r处出现两条带（Fig3B）.2.3HHCC提取物的r6.6×104处出现明显条带（Fig4）.2.4GSTpulldoinvolvescJun/AP1,our［J］.ChinJPathol,2003;32:162-164.［3］张建，王立峰，苏金，等.人NDRG4BcDNA克隆和表达［J］.第
7、四军医大学学报2003;24(13):1218-1220.ZhanJ,ilMedUniv,2003;24(13):1218-1220.［4］BecamelC,GaleottiN,PoncetJ,etal.Aproteomicapproachbasedonpeptideaffinitychromatography,2dimensionalelectrophoresisandmassspectrometrytoidentifymultiproteinplexesinteractingembraneboundreceptors［J］.BiolOn
8、line,2002;41(1):94-104.［5］CangulH,Salnikoancancercells：Apotentialaidtocancerdiagnosis［J］.
